基于WGCNA分析构建新型双硫死亡相关基因标签预测骨肉瘤预后及免疫微环境的研究

《Hormones & Cancer》：Development and validation of a novel disulfidptosis-related gene signature for prediction of survival and immune microenvironment in osteosarcoma by WGCNA analysis

本研究针对骨肉瘤(OS)预后评估困难、个体化治疗策略缺乏的问题，通过WGCNA分析构建了包含BTN3A1、CEBPA、KCNAB2、TBX21和MYC五个双硫死亡相关基因(DRGs)的预后风险模型。研究发现高风险组患者预后较差，免疫检查点基因(如CD274/PD-L1、LAG3等)表达降低，且对顺铂敏感性降低而对多柔比星等药物敏感性增加。实验验证表明BTN3A1在OS细胞中低表达，其过表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭。该模型为OS预后预测和免疫治疗策略提供了新视角。

　　

骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年的恶性骨肿瘤，具有高死亡率和致残率的特点。尽管手术联合辅助化疗使许多患者获益，但发生远处转移（如肺转移）的患者预后仍然很差。骨肉瘤的遗传复杂性和异质性使得准确评估患者预后和制定个体化治疗方案面临巨大挑战。因此，寻找新的生物标志物对患者进行风险分层，并提高个体化治疗的准确性显得尤为迫切。

近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——双硫死亡(disulfidptosis)引起了研究人员的关注。这种细胞死亡主要由细胞内二硫化物异常积累导致的二硫应激引发。在肿瘤缺氧和营养匮乏的微环境中，活性氧(ROS)和脂质过氧化物会积累，而肿瘤细胞通过上调SLC7A11等基因表达，促进胱氨酸摄取并合成大量谷胱甘肽(GSH)以应对氧化应激。有趣的是，研究表明SLC7A11在骨肉瘤中高表达，在保护肿瘤细胞免受氧化应激的同时，也增加了其对二硫应激的敏感性，这提示激活双硫死亡可能成为克服骨肉瘤耐药和转移的新策略。

尽管双硫死亡与肿瘤发展的潜在联系逐渐显现，但其与骨肉瘤的具体关系尚不明确。为探索这一问题，研究人员开展了一项系统研究，旨在构建双硫死亡相关基因(DRGs)标签，用于预测骨肉瘤患者的生存和免疫微环境特征。

本研究主要采用了生物信息学分析与实验验证相结合的策略。从TARGET数据库获取85例骨肉瘤患者的RNA-seq和临床数据，并从GEO数据库下载GSE21257数据集（57例患者）作为验证集。通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)识别与双硫死亡相关的基因模块。利用单因素COX(uni-COX)、LASSO回归和多因素COX(multi-COX)分析筛选预后相关基因并构建风险模型。通过基因集富集分析(GSEA)探索差异表达基因的功能。使用ESTIMATE算法和ssGSEA分析肿瘤免疫微环境。利用pRRophetic R包预测药物敏感性。通过体外实验（包括qRT-PCR、Western blot、CCK-8、Edu、细胞迁移和侵袭实验）验证关键基因的表达和功能。

共识聚类和生存分析

研究人员首先评估了10个已知的双硫死亡核心基因的预后价值，但单因素COX分析显示它们与骨肉瘤预后无显著相关性。基于这些基因的共识聚类分析将患者分为三个亚型，但生存分析显示各亚型间预后无显著差异。

骨肉瘤中双硫死亡相关基因特征的鉴定

通过ssGSEA计算每位患者的双硫死亡评分，并利用WGCNA分析识别与双硫死亡评分最相关的基因模块（MEblack模块），最终确定了338个双硫死亡相关基因(DRGs)。

DRGs风险模型的构建和验证

通过对338个DRGs进行单因素COX、LASSO和多因素COX分析，最终筛选出5个预后相关的DRGs：BTN3A1、CEBPA、KCNAB2、TBX21和MYC。基于这五个基因构建的风险评分模型为：风险评分 = (-0.6691 × BTN3A1) + (-0.6750 × KCNAB2) + (-0.7154 × TBX21) + (0.6052 × MYC) + (-0.4686 × CEBPA)。

根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。生存分析显示，高风险组患者的总生存期显著短于低风险组。时间依赖性ROC曲线显示该模型在预测1年、3年和5年生存率方面具有较高的准确性（AUC值分别为0.89、0.85和0.81）。在独立验证集GSE21257中，该模型同样表现出良好的预测性能。

临床分层分析和独立预后能力评估及列线图构建

亚组分析显示，该风险模型在不同年龄、性别和转移状态的患者亚组中均能有效区分预后。多因素COX回归分析证实该风险评分是骨肉瘤的独立预后因素。研究人员进一步构建了包含风险评分和临床特征的列线图模型，校准曲线和决策曲线分析(DCA)表明该列线图具有较好的预测准确性和临床实用性。

免疫微环境和免疫检查点分析

基因集富集分析(GSEA)显示，高风险组和低风险组之间的差异表达基因主要富集在免疫相关通路，如T细胞活化、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。ESTIMATE分析表明，随着风险评分升高，肿瘤纯度评分增加，而基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分降低。免疫细胞浸润分析显示，高风险组中具有肿瘤杀伤作用的免疫细胞（如活化的CD8⁺ T细胞、CD56^bright自然杀伤细胞等）显著减少。免疫检查点基因（如CD274/PD-L1、LAG3、PDCD1LG2/PD-L2等）在高风险组中的表达水平也较低。

药物敏感性和免疫反应分析

药物敏感性分析显示，高风险组患者对vorinostat、elesclomol、OSI-906、pyrimethamine、thapsigargin和多柔比星的IC₅₀值较低，而对顺铂的IC₅₀值较高。尽管高风险组的TIDE评分较低，但免疫检查点阻断(ICB)治疗反应预测显示，高风险组患者对免疫治疗的反应率较低。

BTN3A1抑制骨肉瘤细胞的恶性表型

实验验证部分显示，BTN3A1、KCNAB2、TBX21和CEBPA在骨肉瘤细胞中的mRNA表达水平显著低于正常成骨细胞hFOB1.19。Western blot证实BTN3A1蛋白在骨肉瘤细胞中低表达。功能实验表明，过表达BTN3A1可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

本研究成功构建并验证了一个包含五个双硫死亡相关基因（BTN3A1、CEBPA、KCNAB2、TBX21和MYC）的风险模型，该模型能够准确预测骨肉瘤患者的预后。研究发现高风险组患者具有免疫抑制性微环境特征，表现为杀伤性免疫细胞浸润减少和免疫检查点分子表达降低。药物敏感性分析提示该模型可能指导个体化化疗选择。实验验证证实BTN3A1在骨肉瘤中低表达，且具有抑制肿瘤恶性行为的作用。

该研究的创新点在于首次将双硫死亡相关基因与骨肉瘤预后和免疫微环境联系起来，不仅提供了可靠的预后预测工具，还为理解骨肉瘤的发病机制提供了新视角。特别是发现BTN3A1作为潜在的肿瘤抑制因子，为骨肉瘤的治疗提供了新的候选靶点。然而，研究也存在一些局限性，如未能验证这五个基因在骨肉瘤组织与正常组织中的表达差异，以及它们的具体生物学功能需要进一步探索。

总体而言，这项研究深化了我们对双硫死亡与骨肉瘤关系的理解，为骨肉瘤的预后预测和治疗策略制定提供了有价值的生物标志物和理论依据。未来研究可在此基础上进一步探索这些基因在骨肉瘤发生发展中的具体机制，并验证该模型在临床实践中的应用价值。