miR-495-3p通过激活Wnt/MAPK通路减轻缺血性脑卒中神经元凋亡的机制研究

《Molecular Neurobiology》：miR-495-3p Attenuates Neuronal Apoptosis Through The Activation of Wnt/MAPK Pathways in Ischemic Stroke

本研究针对缺血性脑卒中治疗时间窗窄、有效手段匮乏的临床难题，探讨了miR-495-3p抑制剂通过调控Wnt/MAPK信号通路对神经元凋亡的抑制作用。研究人员通过OGD/R细胞模型和tMCAo动物模型证实，miR-495-3p-I能显著改善神经功能缺损，减少脑梗死体积，并首次系统阐明了其通过激活经典Wnt通路（上调Cyclin D1/c-Myc）和抑制非经典Wnt/MAPK通路（下调caspase-3/7）的双重神经保护机制。该研究为缺血性脑卒中的 miRNA 靶向治疗提供了新的理论依据。

　　

当大脑的血液供应突然中断，缺血性脑卒中便会发生，这种疾病如同一场悄无声息的"脑内地震"，在短时间内造成大量神经元死亡。更令人担忧的是，目前临床上仅有溶栓和取栓两种主要治疗手段，且必须在中风发作后的"黄金4.5小时"内实施才能发挥最佳效果。超过这个时间窗，治疗不仅效果大打折扣，还可能带来更大的风险。面对这一严峻挑战，科学家们将目光投向了具有自我更新和多向分化潜能的干细胞领域，特别是其衍生物——微RNA（miRNA）的治疗潜力。

在这项发表于《Molecular Neurobiology》的研究中，来自全南大学医学院的研究团队Eunjae Jang、Hee Yu等发现，一种名为miR-495-3p的微小分子可能成为对抗缺血性脑损伤的新武器。研究人员通过生物信息学分析发现，在神经诱导的脂肪间充质干细胞中，miR-495-3p的表达量异常升高，提示其可能参与神经系统的调控过程。

为了验证这一猜想，研究团队设计了一套完整的实验方案。他们首先在细胞水平构建了氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，模拟脑缺血再灌注损伤的环境。通过流式细胞术分析，研究人员惊喜地发现，使用miR-495-3p抑制剂（miR-495-3p-I）处理后，神经元细胞的存活率显著提高，早期和晚期凋亡细胞比例均明显下降。这表明抑制miR-495-3p确实能够保护神经元免于缺血性损伤。

在动物实验方面，研究团队采用了短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）模型，这是研究缺血性脑卒中最经典的动物模型之一。他们在脑缺血后第三天向大鼠脑室内注射miR-495-3p-I，结果发现治疗组大鼠的脑梗死体积显著减小，同时在圆柱实验、身体摆动实验和Zea-Longa神经功能评分等多个行为学测试中，治疗组大鼠都表现出更好的运动功能恢复。

研究人员运用抗体芯片、Western blotting和免疫组织化学等技术，深入探索了miR-495-3p-I发挥作用的分子机制。结果显示，miR-495-3p-I能够同时调控两条重要的信号通路：一方面激活经典的Wnt通路，促进细胞周期蛋白Cyclin D1和原癌基因c-Myc的表达；另一方面抑制非经典的Wnt/MAPK通路，降低caspase-3和caspase-7等凋亡相关蛋白的水平。这种双管齐下的作用机制，最终促进了神经元标志物Tuj1、SYP和NeuN的表达，抑制了促凋亡蛋白Bax的表达，同时提高了抗凋亡蛋白Mcl-1的水平。

关键实验技术概览

本研究综合运用了多种先进技术方法：通过氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）建立体外缺血模型；利用短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）构建大鼠脑缺血模型；采用流式细胞术检测细胞凋亡；通过抗体芯片进行高通量蛋白筛选；运用Western blotting和免疫荧光技术验证关键蛋白表达；进行行为学测试（圆柱实验、身体摆动实验、Zea-Longa评分）评估神经功能恢复；采用TTC染色测定脑梗死体积；利用生物信息学工具（TargetScan、DAVID）进行通路富集分析。

抑制miR-495-3p-I在OGD/R损伤下诱导细胞活力并减少凋亡

为了评估miR-495-3p-I的保护作用，研究人员在HT-22细胞中研究了其对OGD/R诱导的细胞凋亡的影响。与对照组相比，OGD/R组的细胞活力显著降低，并伴有典型的凋亡形态学改变。而经过1 pM和10 pM浓度的miR-495-3p-I处理后，细胞活力显著恢复。流式细胞术分析进一步证实，10 pM的miR-495-3p-I能够显著降低早期和晚期凋亡细胞比例。这些结果表明，抑制miR-495-3p能够提高OGD/R条件下HT-22细胞的活力并减少细胞凋亡。

miR-495-3p-I减少脑缺血并改善tMCAo动物的行为结果

在体实验中，研究人员在缺血性脑卒中后第三天向左脑室注射miR-495-3p-I。TTC染色结果显示，与tMCAo组相比，miR-495-3p-I治疗组的脑梗死面积显著减小。在体重变化方面，假手术组大鼠体重持续增加，而tMCAo组和miR-495-3p-I组在手术后第三天出现暂时性体重下降，但从第六天开始恢复。行为学功能测试显示，miR-495-3p-I治疗组在前肢使用百分比、身体摆动对称性和神经功能评分等方面均优于tMCAo组，表明miR-495-3p-I治疗能够促进缺血性脑卒中后的功能恢复。

抑制miR-495-3p减少脑缺血大鼠脑组织中的凋亡并诱导神经发生

通过对脑组织进行靶标预测和分析，研究人员发现miR-495-3p-I组与tMCAo组之间存在33个与神经发生、细胞生长和细胞周期相关的靶标，以及23个与凋亡相关的靶标。基因本体分析显示，miR-495-3p-I注射组的脑组织中，MAPK相关术语在细胞组分类别中富集，而细胞质和胞质溶胶在分子功能类别中相关。抗体芯片分析发现，与tMCAo组相比，tMCAo+miR-495-3p-I组中有14种蛋白质显著上调，主要来自Bcl家族和神经发生相关蛋白。Western blotting结果进一步证实，促凋亡蛋白Bax、细胞色素c、caspase-3和caspase-7在tMCAo组表达升高，而在miR-495-3p-I组表达降低；相反，抗凋亡蛋白Mcl-1在miR-495-3p-I组表达升高。细胞周期关键调控因子Cyclin D1在tMCAo组下调，而在miR-495-3p-I治疗后恢复。神经发生相关蛋白SYP、Tuj1和NeuN在治疗组显著上调。

miR-495-3p-I对缺血性脑卒中的神经保护作用

为了确定miR-495-3p-I在脑组织中的作用，研究人员使用双皮质素（DCX）、多聚唾液酸神经细胞粘附分子（PSA-NCAM）和NeuN等神经元特异性标志物进行了免疫荧光分析。结果显示，与tMCAo组相比，tMCAo+miR-495-3p-I组的DCX/NeuN和PSA-NCAM/NeuN阳性细胞数量显著增加，表明miR-495-3p-I在缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。

miR-495-3p-I对缺血性脑损伤的抗凋亡作用

通过免疫组织化学分析Bax和Bcl-2等凋亡标志物，研究人员发现tMCAo组Bax阳性细胞数量增加，而miR-495-3p-I治疗组减少；相反，Bcl-2染色细胞在治疗组显著增加。Bax/Bcl-2比率分析进一步支持了miR-495-3p-I在缺血性损伤后的抗凋亡作用。

tMCAo和tMCAo+miR-495-3p-I组中Wnt和MAPK通路的分析

通过QuantSeq和蛋白质组学分析，研究人员在tMCAo+miR-495-3p-I组中鉴定出43个与Wnt和MAPK信号通路相关的差异表达基因。抗体芯片分析揭示了Wnt和MAPK相关蛋白的明显改变。Western blotting验证发现，Wnt通路相关蛋白在治疗组上调，而Rac和p-38-MAPK的表达模式表明MAPK通路受到调控。qPCR分析进一步证实，miR-495-3p-I调控Wnt和MAPK通路基因的表达。

研究结论与意义

本研究通过系统的实验验证，揭示了miR-495-3p-I在缺血性脑卒中中的神经保护机制。研究表明，抑制miR-495-3p能够通过激活经典Wnt通路促进神经元存活，同时通过抑制非经典Wnt/MAPK通路减少细胞凋亡。这种双重调控机制最终导致神经功能改善和脑梗死体积减小。

该研究的创新点在于首次系统阐明了miR-495-3p在缺血性脑损伤中的具体作用机制，为开发新的治疗策略提供了理论依据。特别是发现了其同时调控Wnt和MAPK两条重要信号通路的能力，这为理解 miRNA 在神经系统疾病中的复杂调控网络提供了新的视角。

然而，研究也存在一定局限性，如每组动物数量相对有限，未能全面评估其体内递送的具体调控机制和可能引发的免疫反应。为了成功的临床转化，需要进一步研究其静脉注射后的遗传毒性、生物稳定性和免疫原性效应，并开发高效的递送平台以确保有效靶向缺血脑组织。

总之，这项研究不仅为缺血性脑卒中的治疗提供了新的潜在靶点，也为理解 miRNA 在神经保护中的作用机制提供了重要线索，为后续的转化医学研究奠定了坚实基础。