补体因子D与慢性肾病（CKD）患者心血管死亡及血栓溶解的相关性研究

《Journal of the American Society of Nephrology》：Association of Complement Factor D with Cardiovascular Mortality and Clot Lysis in CKD

CKD患者补体因子D（CFD）水平升高与心血管事件及血栓形成相关，激活替代途径延长凝血溶解时间，且透析患者CFD水平显著更高。

　　

慢性肾病（CKD）患者发生心血管和血栓事件的风险更高，这些事件与促凝表型有关。¹在急性冠状动脉综合征中，CKD与更密集的血栓结构和延长的血栓溶解时间相关。²此外，血栓结构是CKD患者死亡率的显著预测因素。³值得注意的是，补体系统与CKD密切相关，CKD患者的尿液中发现的补体激活产物与肾小球疾病的严重程度和肾功能损害有关。⁴⁵尽管关于补体激活和血栓形成的证据不断积累，但目前仍不清楚在CKD中激活的是哪一条补体通路（即经典通路、凝集素通路或替代通路）。因此，我们试图研究补体蛋白及其相应通路在CKD中的作用，以及它们在促凝表型形成中的作用。

该分析基于英国生物银行（UK Biobank）的数据，这是一个包含约50万参与者的前瞻性队列，这些参与者于2006年至2010年间在英国招募。使用Olink Explore 3072技术获得了44,856名个体的补体蛋白蛋白质组数据。心血管事件根据国际疾病分类标准（ICD）的住院记录和死亡记录进行定义，包括心血管死亡（与ICD 100-199编码相关）、心肌梗死（I21-I22）和中风（I60-I69）。中位观察时间为15.7年（四分位数范围：14.9-16.5年）。纤维蛋白血栓的特性通过一种经过验证的浊度测定法在柠檬酸血浆中进行评估，该方法通过测量最大吸光度来评估血栓密度，并确定从血栓完全形成到50%溶解所需的时间。为了验证这些结果，还评估了健康个体和接受血液透析的CKD患者的血液样本。所有参与者均提供了知情同意书，并且没有感染或抗炎治疗的历史。所有实验均获得了亚琛大学医院伦理委员会的批准（批准编号EK 233/19，详细信息见^{补充材料）。}

在所有可用的补体蛋白中，限速的替代通路（AP）蛋白——补体因子D（CFD）与估算的肾小球滤过率（eGFR，由CKD-Epidemiology Collaboration计算）之间的相关性最强，相关系数为0.36（P < 0.001；图1A）。因此，后续所有分析都以CFD为中心。实际上，CKD患者中经常观察到高水平的CFD，而且已证明CFD通过促进自发水解的C3(H₂O形成C3转化酶来增加AP的活性。^{6为了评估CFD对心血管疾病和血栓结局的影响，我们将患者分为三个组别，并评估了主要不良心血管事件（MACE），包括心血管死亡、非致命性心肌梗死和非致命性中风（图1B）。在调整了年龄、性别、糖尿病、高血压、心肌梗死、冠状动脉疾病、N端B型利钠肽（NTproBNP）、eGFR、高灵敏度C反应蛋白（hsCRP）、体重指数（BMI）和尿白蛋白-肌酐比率（UACR）等因素后，CFD仍然是MACE的独立预测因子（风险比，1.44 [95%置信区间，1.18至1.75]，图1B），以及MACE的各个组成部分（心血管死亡和非致命性心肌梗死）。为了研究CFD与eGFR之间的病理关系，我们根据CFD水平将患者分为不同的风险组（即CKD G1-2 A1、CKD G1-2 A2-3和CKD G3-5 A1-3）。结果表明，CFD水平最高的组别以及CKD G3-5组的患者发生MACE的风险最高，风险比为2.71（95%置信区间，2.06至3.60；图1C）。鉴于CFD与血栓结局之间的强烈关联，我们研究了CFD对纤溶酶诱导的血栓溶解时间的影响，这是心血管和血栓事件的一个已知预测指标。Zymosan诱导的AP在血浆中的激活显著延长了血栓溶解时间（837±99秒对比585±74秒，P < 0.01）。这种效应可以通过预先加入CFD抑制剂Danicopan来消除，使溶解时间恢复到对照组水平（图1D）。相反，在缺乏CFD的血浆中重新加入CFD显著延长了Zymosan诱导的血栓溶解时间（1179±179秒对比855±193秒，P < 0.05；图1E）。这些数据表明CFD、替代通路的激活和血栓溶解时间之间存在密切关系。}

图1：

补体因子D水平的升高预示着主要心血管事件的发生，并将替代通路的激活与血栓溶解抵抗性的增强联系起来。（A）英国生物银行中评估的补体蛋白的Spearman相关性图。OLINK 3072释放的蛋白质组数据涵盖了44,856名患者。红色条形表示正相关，蓝色条形表示负相关。（B）根据CFD水平划分的主要不良心血管事件（MACE）发生率。数据截止于最后一次事件。左上角为MACE，左下角为心血管死亡，右上角为心肌梗死，右下角为中风。Cox比例风险模型调整了年龄、性别、糖尿病、高血压、心肌梗死、冠状动脉疾病、NTproBNP、eGFR、hsCRP、BMI和UACR等因素。适当情况下使用了对数转换和限制性三次样条曲线来处理非线性关系和偏态分布。分析了包含变量之间的相互作用，并根据需要将其纳入模型。（C）根据CFD水平和是否存在CKD（即CKD G1-2 A1 [eGFR >60 ml/min 和 UACR <30 mg/μ/mL]）对MACE进行分层。在某些情况下，血浆与CFD抑制剂Danicopan（1 μg/ml）预孵育30分钟。（E）通过浊度法和溶解试验评估缺乏CFD的血浆中的纤溶酶诱导的血栓溶解时间。血浆处理方式与（D）相同，有的添加了1 μg/ml的CFD（Sigma Aldrich），有的未添加。（F）在健康对照组和接受血液透析的患者的血浆中，分别添加了10 mg/ml的Zymosan（Sigma Aldrich）后，评估了纤溶酶诱导的血栓溶解时间。所有实验均按照（D）中的描述进行。（G）使用Hycult Biotech公司的试剂盒进行CFD的酶联免疫吸附测定。（H）使用Quidel Ortho公司的试剂盒进行补体片段Bb的酶联免疫吸附测定。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。BMI：体重指数；CFD：补体因子D；HR：风险比；hsCRP：高灵敏度C反应蛋白；MACE：主要不良心血管事件；NTproBNP：N端B型利钠肽；UACR：尿白蛋白-肌酐比率。

接下来，我们在类似条件下进行了实验，比较了接受血液透析的患者（n=10）和健康对照组（n=10）。结果发现，接受血液透析的患者的血栓溶解时间显著长于健康对照组（血液透析组：2743±1009秒对比对照组：1202±631秒，P < 0.001），而Zymosan进一步延长了这一时间。值得注意的是，接受血液透析患者的血栓溶解时间延长与血浆中CFD水平的升高有关（健康对照组：0.71±0.14 μg/ml对比血液透析组：8.13±5.27 μg/ml，P = 0.003，图1G）以及片段Bb水平的升高（健康对照组：0.79±0.16 μg/ml对比血液透析组：1.37±0.67 μg/ml，P = 0.02，图1H），这表明血液透析患者的AP活性风险更高。

总之，我们的研究表明，CKD患者中CFD和AP活性的升高会触发促凝表型，并将补体活性与更高的血栓事件发生率联系起来。