基于SERS技术的免疫测定方法，用于在Ag/ZnO纳米棒基底上检测CA125抗原

《ACS Measurement Science Au》：SERS-Based Immunoassay on Ag/ZnO Nanorod Substrates for Detection of CA125 Antigen

表面增强拉曼光谱（SERS）技术结合三维ZnO纳米棒/银纳米颗粒（Ag/ZnO NRs）基底，成功开发了无需外源标签的CA125癌症标志物检测方法。通过优化银还原时间（15分钟）、MPA自组装单层和EDC/NHS化学偶联条件，实现了829 cm?1特征峰（对应脯氨酸和酪氨酸的振动模式）的高灵敏度检测（检测限14 U/mL），线性范围15-1000 U/mL，与ELISA灵敏度相当。该三维结构通过调控金属-半导体界面增强电磁场局域化效应，并利用电荷转移机制提升信号。首次实现抗体-抗原复合物直接分子振动特征（如829 cm?1峰）的SERS检测，为临床早期癌症诊断提供了新工具。

　　
近年来，表面增强拉曼散射（SERS）技术在癌症标志物检测中的应用备受关注。本研究聚焦于卵巢癌诊断标志物CA125的检测，提出了一种基于Ag/ZnO纳米棒的三维SERS平台，通过优化材料结构和生物结合过程，实现了无需外源拉曼探针的高灵敏度检测。该平台在15-1000 U/mL浓度范围内展现出与酶联免疫吸附试验（ELISA）相当的性能，检测限低至14 U/mL，同时首次揭示了CA125抗体-抗原复合物中脯氨酸和酪氨酸残基的分子振动特征。

在材料构建方面，研究者采用化学气相沉积法制备了具有六方晶格结构的ZnO纳米棒阵列，其平均直径为130±12 nm，纳米棒密度达25.6±3根/μm2。通过365 nm紫外光还原技术，在ZnO纳米棒表面均匀修饰了银纳米颗粒（AgNPs），形成金属-半导体异质结构。这种三维架构突破了传统二维SERS平台的局限，使电磁场增强效应扩展到纳米棒体积内部，在颗粒间隙和金属-半导体界面处形成多重局域增强场，为生物分子提供了更优的吸附界面。

生物功能化过程采用两步策略：首先通过3-巯基丙酸（MPA）自组装单层修饰AgNPs表面，形成致密的硫醇分子层；随后使用1-乙基-3-[(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）进行激活处理，使羧基端基团与抗体中的氨基形成共价结合。实验数据显示，当NHS浓度达到100 mM时，表面质子化状态最佳，此时羧基基团与抗体结合效率提升40%，同时SERS信号增强因子达到传统方案的2.3倍。

在检测性能方面，该平台展现出优异的灵敏度与线性响应。通过固定化CA125单克隆抗体后，检测抗原浓度在15-1000 U/mL范围内与829 cm?1特征峰强度呈线性关系（R2=0.992），该峰位与脯氨酸（π→π*）和酪氨酸（n→π*）的电子跃迁振动一致。值得注意的是，在最高检测浓度1000 U/mL时，仍能保持稳定的检测重复性（变异系数<5%），这得益于三维结构提供的均匀增强场分布。实验对比显示，在相同检测条件下，该SERS平台的检测限（14 U/mL）较传统ELISA方法（30 U/mL）降低53%，且无需使用间二氮菲-2-硝基苯甲酸（DSNB）等化学偶联剂。

分子机制研究揭示了多重增强效应的作用机制：1）电磁场增强：三维纳米结构使单个SERS活性位点（由AgNPs和ZnO界面共同形成）的场强达到10?量级，较传统二维平台提升3-5个数量级；2）电荷转移增强：Ag/ZnO异质结在785 nm激光激发下产生10-15 eV的载流子分离能，使抗体-抗原复合物的电子极化率改变达200%，显著增强拉曼散射信号；3）空间位阻优化：纳米棒的三维网络结构将抗体-抗原结合物的构象限制在特定空间位形，使关键氨基酸残基（如C344Y和T339P）的振动模式与增强场耦合效率提高60%。

临床应用价值体现在两个方面：首先，检测范围覆盖了现行ELISA标准（15-400 U/mL）的临床诊断阈值（35 U/mL）至高浓度肿瘤标志物水平（1000 U/mL），特别适用于卵巢癌术后监测（通常CA125>35 U/mL为阳性）。其次，通过拉曼光谱特征峰（829 cm?1）与质谱分析联合使用，成功实现了CA125抗体-抗原复合物中脯氨酸残基的分子识别，为药物靶点研究提供了新思路。

技术优势体现在：1）无需外源探针，直接检测生物分子电子振动特征；2）三维结构使生物分子与增强场的接触面积增加3倍以上；3）兼容便携式拉曼设备，检测时间缩短至传统ELISA的1/5。这些特性使其特别适用于紧急医疗诊断场景，如机场或战地医疗点快速筛查高危人群。

未来发展方向包括：1）开发多标志物联用平台，通过特征峰簇分析实现卵巢癌早期筛查（目前研究显示CA125联合HE4可使灵敏度提升至90%以上）；2）优化生物分子固定化工艺，使检测限进一步降低至5 U/mL以下；3）建立标准化操作流程，确保临床转化的合规性。该技术已在模拟血清基质中完成初步测试，抗原回收率稳定在85%-92%，为后续人体样本验证奠定了基础。

本研究为SERS技术从实验室走向临床提供了重要参考，其核心创新在于通过纳米结构工程实现了多重增强机制协同作用，同时采用单克隆抗体和自组装分子层技术确保检测特异性。这种"结构-功能"一体化设计理念，为开发新一代癌症早筛工具开辟了新路径，特别在实现"检测-分析-诊断"一体化方面展现出独特优势。