《Food Microbiology》：The
lldD Lactate Dehydrogenase is a Determinant of Lactic Acid Tolerance in
Pichia kudriavzevii by Pyruvate Metabolism Pathway
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本研究探究了毕赤酵母Pichia kudriavzevii的乳酸耐受机制，通过转录组分析和CRISPR-Cas9技术敲除关键基因lldD，发现其显著影响乳酸耐受性及氨基酸代谢途径，为工程高耐受性酵母菌株开发提供理论依据。
张慧|韩美月|庞泽民|李伟伟|李秀婷|孙宝国
北京工商大学老年营养与健康重点实验室，教育部，北京，100048，中国
摘要
乳酸胁迫在传统发酵食品中很常见。Pichia kudriavzevii因其优异的耐酸性而在工业上得到广泛应用，因此揭示其响应机制对于实现可持续的发酵过程至关重要。本研究探讨了P. kudriavzevii的显著耐酸能力，该菌种能够耐受80 g/L的乳酸。通过转录组分析确定了P. kudriavzevii的关键耐酸基因lldD。重要的是，本研究首次利用CRISPR-Cas9技术敲除了与耐酸性相关的关键基因lldD，并成功构建了lldD敲除菌株（pk-ΔlldD）。pk-ΔlldD与P. kudriavzevii在耐酸性、乳酸代谢、葡萄糖利用以及乙醇生成方面存在显著差异。此外，lldD基因的缺失对P. kudriavzevii中的ABC转运蛋白和氨基酸代谢途径的代谢物产生了显著影响。总之，本研究为通过靶向基因修饰工程化高耐酸性的工业酵母菌株提供了理论基础，有助于提高乳酸胁迫下的发酵过程稳定性，从而为发酵产业的高效低损耗生产奠定基础。
引言
在古代，人类就已经利用微生物发酵来改善食品风味并延缓食品变质（张等，2023）。随着技术的发展，人们发现发酵食品还能为胃肠道提供大量有益微生物，这对人类健康具有积极作用（Sharma等，2020；Rezac等，2018；Tamang等，2020）。在发酵食品的生产中，微生物发酵常被用来提高生产效率和产品质量（Hernández-Velázquez等，2024）。然而，在白酒等发酵食品的生产过程中，乳酸等有机酸的积累和pH值的下降常常会对微生物造成酸胁迫（Wang等，2022a；Liu等，2024）。这些胁迫因素会严重影响微生物的代谢，破坏细胞膜，抑制酶活性，甚至导致微生物死亡，从而降低发酵产品的质量。因此，提高微生物的耐胁迫能力对于提升发酵食品的质量至关重要（Biase等，2015；Guan等，2020；Pan等，2020）。
发酵食品中的酵母有助于改善产品风味、增强食品质地，并提高酒精饮料的发酵效率（Guidi等，2023；Lu等，2021）。酵母的环境胁迫耐受性不仅影响发酵食品生产过程中微生物群落的演替，还与其质量密切相关（Wang等，2022b；Wang等，2023a；Zeng等，2023）。Pichia是白酒发酵过程中的优势真菌属（张等，2021）。Pichia kudriavzevii（也称为Issatchenkia orientalis）是白酒发酵中的主要物种（Chu等，2023），是酿造过程中的核心功能微生物（You等，2021；Huang等，2020）。P. kudriavzevii具有良好的耐酸性、耐乙醇性和耐高温性，在多种压力下仍能保持优异的发酵特性（Rahman等，2022；Hoppert等，2022；Wada等，2020；Ndubuisi等，2020）。此外，P. kudriavzevii可以降低发酵系统中的乳酸浓度，调节酿造微环境的酸度，并增强共培养酵母的耐酸性（Deng等，2020）。
尽管P. kudriavzevii在缓解白酒发酵过程中的乳酸胁迫方面具有重要意义，但其具体的耐酸机制仍不清楚。以往的研究分析了与P. kudriavzevii对酸胁迫响应相关的基因，但缺乏通过基因操作进行的功能验证（Akita等，2023；Du等，2022）。为填补这一知识空白，本研究以P. kudriavzevii为研究对象，探讨其耐酸机制。同时，通过转录组和代谢组分析，研究了P. kudriavzevii对酸胁迫的响应模式，并利用CRISPR-Cas9技术研究了lldD在耐酸中的作用。最后，通过代谢组学分析了pk-ΔlldD和pk在乳酸胁迫下的代谢物变化，以验证lldD的作用。对P. kudriavzevii耐酸机制的初步探索揭示了酵母的一种关键胁迫耐受策略，为开发强健的工业菌株提供了基因工程方法。
实验部分
采样与乳酸耐受性测试
P. kudriavzevii pk-x-8是从实验室菌株中分离得到的。P. kudriavzevii pk-x-8在YPD培养基中于30 °C和180 rpm条件下活化。活化后的菌株被加入含有不同浓度乳酸（0 g/L、20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L）的YPD培养基中，并在30 °C下培养72小时。每12小时取样一次，并测定OD600值。
生物量、酸含量、葡萄糖含量和乙醇产量的测定
发酵液预处理：取1 mL发酵液，以13,000 rpm离心2分钟，将上清液转移到新的培养基中P. kudriavzevii pk-x-8的乳酸耐受性
研究了P. kudriavzevii pk-x-8的耐酸性。图1A显示，添加20 g/L和40 g/L乳酸对P. kudriavzevii pk-x-8的生长影响较小。然而，当乳酸浓度增加到60 g/L和80 g/L时，P. kudriavzevii pk-x-8的生长受到明显抑制，当乳酸浓度达到100 g/L时，其生长受到显著抑制。结合实验结果和文献讨论
在白酒发酵过程中，乳酸是微生物代谢产生的主要有机酸，会导致发酵谷物的酸度迅速升高，进而降低细胞内pH值，从而影响微生物的生长和产物合成（张等，2018；韩等，2021）。本研究中的P. kudriavzevii pk-x-8具有较高的耐酸性，能够耐受80 g/L的乳酸（Liangcai等，2023）。乳酸的添加
结论
微生物的耐酸性使它们能够在酸胁迫下保持生理活性，从而具有良好的产物合成能力或实际应用效果。因此，这些耐酸微生物如何维持正常生长和代谢及其耐酸机制尤为重要。研究表明，P. kudriavzevii pk-x-8能够耐受80 g/L的乳酸，并通过消耗乳酸来应对酸胁迫。
作者贡献声明
张慧：撰写——原始草稿、可视化、验证、资源收集、调查、数据分析、数据整理。韩美月：调查、数据分析。庞泽民：方法学设计。李伟伟：撰写——审阅与编辑、方法学设计。李秀婷：监督、概念构建。孙宝国：概念构建
未引用的参考文献
Akita和Matsushika，2023；Biase和Lund，2015；Ford和Beis，2019；Guan和Liu，2020；Hernández-Velázquez等，2018；Hoppert等，2023；Pastink，2009；Ramos等，2016；Tamang等，2018；Wang等，2022。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFD2101401）的财政支持。
