合成并发现瓜雅诺利德-欧德斯马诺利德异二聚体作为CDK2抑制剂，用于治疗肝细胞癌

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Synthesis and discovery of guaianolide ‐ eudesmanolide heterodimers as CDK2 inhibitors for the treatment of hepatocellular carcinoma

肝癌治疗新策略：基于Diels-Alder反应合成26个蓖麻油二萜异源二聚体，其中氯代化合物10对HepG2等细胞抑制活性显著优于索拉非尼（IC50低3.9-6.1倍），通过靶向降解CDK2-Cyclin A2复合物诱导细胞周期停滞和衰老，体内实验显示其抑制肿瘤生长达69%，且无显著毒性。

　　

李天泽|李凤娇|胡敏敏|黄风丹|马云宝|杨瑶|王永翠|陈继军

中国科学院昆明植物研究所，植物化学与天然药物国家重点实验室，中国昆明650201

摘要

肝细胞癌（HCC）仍然是癌症相关死亡的主要原因之一，这迫切需要具有独特机制的新治疗药物。受到天然倍半萜二聚体抗HCC特性的启发，并为了克服其结构多样性和可用性的限制，通过Diels-Alder反应合成了26种新的guaianolide–eudesmanolide异二聚体。抗HCC实验表明，19种类似物在HepG2、SK-Hep-1和Huh7细胞上的抑制活性优于索拉非尼。令人惊讶的是，氯化二聚体10表现出卓越的活性，其IC₅₀值比索拉非尼高3.9–6.1倍，能够抑制细胞迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。通过CETSA、DARTS和功能敲低实验确认，CDK2是化合物10的作用靶点。分子对接和分子动力学模拟预测，化合物10作为一种新型的非ATP竞争性CDK2抑制剂。化合物10以236.7 nM的IC₅₀值抑制CDK2/Cyclin A2，破坏了它们的相互作用，通过溶酶体途径促进CDK2降解，最终导致G0/G1期细胞周期停滞和细胞衰老。体内实验中，30和60 mg/kg剂量的二聚体10分别抑制了64%和69%的肿瘤重量，且未检测到毒性，IHC分析证实了其在体内对靶点的结合。本研究将化合物10确定为一种潜在的抗HCC药物，值得进一步研究。

引言

肝细胞癌（HCC）是一种常见且高发的原发性肝癌，预后较差，在全球发病率中排名第六，在癌症相关死亡率中排名第三[1]。尽管在治疗策略方面取得了巨大进展，包括靶向治疗、免疫治疗和联合治疗，但由于药物有限、药物耐药性的产生以及明显的副作用，晚期HCC患者的整体预后仍然不佳[2]。这一未满足的医疗需求凸显了对具有独特结构和机制的新抗HCC药物的迫切需求。

细胞周期失调——表现为异常有丝分裂和肿瘤细胞的无控制增殖——是癌症发生的标志[3]。因此，开发针对细胞周期检查点的药物是癌症治疗的关键策略。周期依赖性激酶（CDKs）在肿瘤发生和发展中的细胞周期和增殖中起着关键作用，这使它们成为癌症治疗的理想靶点[4]。选择性CDK4/6抑制剂的临床成功验证了这一概念[5]。CDK2是一个有吸引力的靶点，因为它在细胞周期调节中起着关键作用，并且能够克服CDK4/6抑制剂的耐药性[6]。几种选择性CDK2抑制剂[7]，包括INX-315 [8]、cirtociclib（BLU-222）[9]、tagtociclib（PF-07104091）[10]、AZD8421 [11]、INCB123667 [12]、AVZO-021（ARTS-021）、NKT3447和BG-68501 [6]已进入癌症治疗的临床试验（图1）。还有一些候选药物，如AU14-5、BLU0298、BLU2256和BLU1954，正处于临床前开发阶段。

我们之前的研究表明，来自青蒿属植物的几种倍半萜二聚体（SDs）通过抑制细胞周期显著抑制了HCC细胞的增殖。其中，lavandiolide H [13]、artemiprincepsolide A [14]、artemiprinolide A [15]和artemeriopodin G7 [16]通过下调Cyclin B1和pcdc2将细胞周期阻断在G2/M期。而artemidubolide D [17]和artemzhongdianolide B9 [18]通过调节p21、CDK4、CDK6和Cyclin D1的水平将细胞周期阻断在G0/G1期。这些结果表明，倍半萜二聚体可以作为细胞周期调节剂。然而，由于这些二聚体在植物中的含量较低，对其作用机制和体内抗肿瘤活性的深入研究受到限制，而SDs的结构复杂性使得完全合成极具挑战性[19]。从结构上看，倍半萜二聚体通常由相同的倍半萜衍生而来[20]，结合不同倍半萜骨架的异二聚体在自然界中相对较少。因此，合理设计和大规模合成新型倍半萜异二聚体对于发现具有抗HCC活性的新CDK抑制剂具有重大意义。

在这项研究中，我们设计并合成了结构新颖的guaianolide-eudesmanolide异二聚体，这些异二聚体来源于天然丰富的倍半萜，并评估了它们在HepG2、SK-Hep-1和Huh7细胞上的抗肿瘤活性。据我们所知，从未有过关于guaianolide-eudesmanolide异二聚体的合成、化学修饰和构效关系的报道。本研究还研究了最活跃化合物10的靶点、抗HCC机制和体内抗HCC活性。

化学

在我们之前的研究中，我们利用易于获得的天然产物arglabin，通过Diels-Alder反应建立了一条合成guaianolide二聚体lavandiolides H、I、K和artematrolide F的仿生合成路线[21]。值得注意的是，这些二聚体的抗肿瘤活性比它们的单体前体更强。Eudesmane型倍半萜是一类具有由两个六元碳环组成的双环框架的倍半萜亚类

结论

成功设计并合成了一系列含有卤素、硒或硫原子的guaianolide–eudesmanolide异二聚体，这是此类异二聚体的首次报道。这些合成二聚体显示出比其单体前体更强的抑制效果，在HepG2、Huh7和SK-Hep-1细胞上的活性优于索拉非尼。特别是氯化二聚体10表现出强烈的抗增殖活性，有效抑制了细胞增殖

化合物1–6的合成通用步骤

根据文献方案[22,23]，从costunolide合成了包括α-cyclocostunolide（A1）、β-cyclocostunolide（A2）、γ-cyclocostunolide（A3）、santamarin（B1）、reynosin（B2）和magnolialide（B3）在内的eudesmanolides。Ar?абин衍生的二烯C1和guaianolide–germacranolide二聚体C2是使用我们之前报道的方案制备的[21]。

将0.15 mmol（1.5当量）的eudesmanolides（溶于2 mL的CH₂Cl₂）与arglabin衍生的二烯C1（29 mg，0.1 mmol，1.0当量）反应

CRediT作者贡献声明

李天泽：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理。李凤娇：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，正式分析，数据管理。胡敏敏：方法学，研究。黄风丹：方法学，研究，概念化。马云宝：验证。杨瑶：方法学，研究。王永翠：撰写 – 审稿与编辑，正式分析，

资金来源

本工作得到了国家自然科学基金（22137008、82473809）、星电英才项目（YNWR-KJLJ-2019-002）和云南省中青年学术和技术领军人才储备计划（202105AC160021）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。