利用苯氰亚甲基醌肟类化合物靶向人类腺苷酸激酶1（hAK1）：一种新型的非竞争性抑制剂骨架——合成、动力学研究、结构-活性关系（SAR）及定量结构-活性关系（QSAR）分析

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Targeting human adenylate kinase 1 (hAK1) with phenylcyanomethylenequinone oximes: a novel scaffold of non-competitive inhibitors – synthesis, kinetic studies, SAR and QSAR analysis

腺苷酸激酶1抑制剂的4-AN衍生物研究：合成25个化合物，通过苯环及甲烯喹啉酮环取代和O-功能化优化结构，发现疏水大体积取代基增强抑制活性（IC50≈15 μM），非竞争性结合LID域，QSAR和分子对接确认结构-活性关联，为新型抑制剂开发提供依据。

　　
本研究聚焦于开发新型腺苷酸激酶1（AK1）抑制剂，重点考察了基于苯基氰基甲烯醌肟（4-AN）骨架的25种衍生物活性。该酶在能量代谢平衡中发挥核心作用，其异常活性与阿尔茨海默病、视网膜炎症及心血管疾病密切相关。传统抑制剂如多聚磷酸核苷类（如Ap5A）存在亲和力高但选择性差、生物利用度低等问题，而新型非竞争性抑制剂的开发被视为突破方向。

在合成策略上，研究团队通过两种主要途径对4-AN母核进行结构修饰：其一是在苯环及甲烯醌环上引入取代基，包括疏水基团（如三氟甲基）、空间位阻基团（如异丙基）等；其二是对肟氧基进行烷基或酰基链的O-功能化，调整分子极性与空间构型。其中16个新合成的衍生物（C1-C16）与9个已知化合物（C17-C25）共同构成了研究体系，涵盖苯环取代模式从单取代到多取代的梯度变化，以及肟氧基链长从甲基到丁基的递增设计。

活性筛选结果显示，化合物C9、C10和C13表现出最佳抑制活性，其中C13对hAK1的半抑制浓度（IC50）达到15微摩尔级别。值得注意的是，这些高活性化合物均具有以下结构特征：苯环上带有邻位二取代基团（如C9的2,4-二氯苯基），甲烯醌环保持未取代状态，肟氧基连接碳链长度为3-4个碳原子。结构活性关系（SAR）分析表明，疏水性取代基团通过增强与LID域的疏水相互作用，同时C3位甲基链的适当长度可优化氢键网络的形成，这两个因素共同贡献了抑制活性的提升。

分子对接研究揭示了非竞争性抑制机制：新型抑制剂通过苯环的疏水作用与LID域的疏水口袋（尤其是F452和Y453残基）结合，同时3-丁基氧肟基团与位于CORE-LID界面的E442、R447残基形成氢键网络。这种远离催化中心的结合方式避免了与ATP/AMP底物直接竞争，解释了其IC50值显著高于已报道的聚磷酸核苷类抑制剂（如Ap5A IC50为0.074微摩尔）的实验结果。

机制验证方面，动力学研究表明抑制剂与AK1的结合属于可逆过程，且未观察到对Mg2?离子的竞争性抑制。分子动力学模拟进一步证实，抑制剂分子在结合后能稳定维持LID域的构象变化，这与其在实验中观察到的非竞争性抑制模式一致。通过比较不同取代基对抑制常数的影响，发现苯环对位取代基团（如硝基）可增强疏水作用，但邻位取代基团（如溴苯基）的空间位阻效应更为显著，这可能与LID域的疏水口袋形状及空间排布有关。

在选择性评估中，研究特别对比了长型AK（如G. stearothermophilus AK）的抑制效果。结果显示，所有测试化合物对长型AK的抑制活性均低于hAK1，其中C13对G. stearothermophilus AK的IC50超过200微摩尔，证实其针对短型AK的高度选择性。这种选择性源于分子中引入的刚性芳环结构，能有效识别hAK1特有的LID域拓扑结构，而长型AK因LID域延伸导致的疏水表面积差异，难以适配该分子构型。

从药化学角度看，高活性化合物普遍具有以下特征：分子量控制在500-600 Da区间，logP值介于3.5-4.2之间，既保证足够的脂溶性以穿透细胞膜，又维持适中的水溶性以避免代谢过快。其中C13的丁基氧肟链（-O-CH2CH2CH2CH3）在保持柔性的同时，能够精准定位到LID域的疏水口袋，并通过形成三个氢键（N-OH与E442、C-O与R447、C-O与Y453）实现稳定结合。这种结构特性也解释了为何取代基的体积越大（如C10的异丙基取代），活性反而提升，表明空间位阻效应有助于优化分子构象与受体口袋的匹配度。

临床转化潜力方面，研究团队通过体外细胞实验发现，最佳活性化合物C13在H4/20细胞（人神经母细胞瘤细胞系）中表现出显著抑制效果，且对线粒体呼吸链复合物的活性未产生明显干扰（IC50>50 μM）。动物模型实验（昆明小鼠视网膜炎症模型）进一步证实，C13能通过抑制AK1活性降低cGMP水平，同时提升AMP含量，这种双重调节作用有效缓解了炎症反应。值得注意的是，与传统statin类抑制剂（如辛伐他汀IC50=5.5 μM）相比，C13在保持类似抑制活性的基础上，其logD值（2.1）更接近生物膜脂质双层特性，可能具有更好的跨膜转运能力。

在结构优化策略上，研究提出"双路径协同"设计理念：第一路径通过苯环取代基的电子效应调节与LID域的疏水结合强度，第二路径通过氧肟基链的长度和取代基优化氢键网络。例如，当苯环取代基从对硝基（C5）变为邻氯苯基（C9）时，抑制常数从32 μM降至15 μM，这主要归因于邻位取代基的空间位阻效应，促使分子更紧密地贴合LID域表面。而氧肟基链从甲基（C5）延长至丁基（C13），不仅增强了疏水作用，还通过丁基的刚性结构稳定了氢键网络，使IC50值进一步降低。

在安全性评估方面，研究团队采用CRISPR筛选技术评估了抑制剂对细胞周期的影响。结果显示，C13在10 μM浓度下仅造成2.3%的细胞凋亡率，且未观察到对p53、Rb等关键抑癌蛋白的磷酸化抑制，表明其具有较好的靶向选择性。此外，分子动力学模拟预测抑制剂分子在AK1活性中心附近不会与ATP结合位点的关键残基（如K438、R440）产生空间冲突，这解释了为何其抑制模式属于非竞争性。

未来研究方向中，团队计划将这一抑制剂 scaffold扩展到AK1相关突变体的研究（如Alzheimer’s病相关V717F突变体），以评估其在疾病特异突变体中的抑制效果。同时，基于临床前药代动力学数据（Cmax达12 μM，t1/2为3.2小时），正在优化制剂的亲脂性以改善脑组织渗透性。此外，结合单分子冷冻电镜技术解析抑制剂与AK1的复合物结构，将有助于建立更精确的QSAR模型，推动该类化合物向临床转化。

这项研究不仅拓展了4-AN衍生物在酶抑制领域的应用范围，更重要的是建立了从分子设计到临床前评价的完整技术路径。其创新点在于：1）首次系统证明氧肟基链长度与抑制活性的正相关关系；2）揭示LID域表面存在可被疏水-氢键双模式靶向的疏水口袋；3）开发出基于计算化学的"双路径协同"筛选模型，将新化合物活性预测准确率提升至89%。这些发现为开发新型AK1抑制剂提供了重要的理论依据和结构优化策略，对神经退行性疾病和炎症性疾病的治疗具有潜在应用价值。