对澳大利亚和新西兰恶性高热易感患者中RYR1变异体的功能分析

《British Journal of Anaesthesia》：Functional analysis of RYR1 variants in Australian and New Zealand patients at risk of susceptibility to malignant hyperthermia

恶性高热易感性的诊断方法及RYR1基因变异分类研究。通过amplicon和全外显子测序筛查7例恶性高热临床史患者的RYR1基因变异，并利用钙释放实验和EMHG评分矩阵进行功能验证。最终确认4个新致病突变，1个升级为致病，1个仍为不确定意义，为MH诊断提供新依据。

　　

安雅·H·希曼（Anja H. Schiemann）、索菲·M·伯林（Sophie M. Burling）、雷迈·艾伦（Remai Allen）、特拉莎·布尔杰（Terasa Bulger）、罗斯林·G·马洪（Roslyn G. Machon）、玛格丽特·佩里（Margaret Perry）、尼尔·斯特里特（Neil Street）、卢克·R·范登贝塞拉尔（Luuk R. van den Bersselaar）、凯瑟琳·M·斯托威尔（Kathryn M. Stowell）

新西兰帕默斯顿北市梅西大学（Massey University）食品技术与自然科学学院（School of Food Technology and Natural Sciences）

摘要

背景

肌肉活检和体外收缩测试仍是恶性高热易感性的无症状诊断的金标准。当家族性变异被归类为致病性或可能致病性时，可以使用DNA分析。为此，这些变异必须满足一系列标准，其中之一是在经批准的系统中进行的功能分析，以证明其在暴露于适当激动剂时表现出钙释放的过度敏感性。

方法

对七名具有恶性高热临床病史的患者进行了RYR1基因变异的筛查，方法包括扩增子测序或全外显子测序。随后将六个RYR1基因变异引入编码人类Ryanodine受体的cDNA中，并在人类胚胎肾细胞中测试它们对4-氯-m-creol引起的钙释放的影响，使用fura-2作为钙指示剂。每个变异都根据欧洲恶性高热组（EMHG）评分矩阵和ClinGen RYR1变异鉴定专家小组的指南进行了计算机模拟分析。

结果

所有六个研究的RYR1基因变异（p.Gln464Lys、p.Asp2431Val、p.Val2354Met、p.Ser2542Asn、p.Val2627Leu和p.Pro4973Leu）对4-氯-m-creol均表现出过度敏感性。根据EMHG评分矩阵，四个变异（p.Gln464Lys、p.Asp2431Val、p.Val2354Met和p.Val2627Leu）被重新分类为致病性，一个变异（p.Pro4973Leu）从可能致病性升级为致病性，而一个变异（p.Ser2542Asn）仍被归类为“意义不确定”。

结论

另有四个RYR1基因变异可加入EMHG管理的RYR1疾病相关变异列表中，因此未来可用于诊断。其中一个变异从可能致病性升级为致病性，而另一个变异的意义仍不明确。

部分内容摘录

临床病史

RYR1基因筛查的病例是根据临床恶性高热反应选定的。在所有情况下，通过IVCT（基因测序）确认了与恶性高热易感性的潜在关联。如果受试者无法进行IVCT，则由其近亲代替。可用数据汇总见表1。包括通过IVCT和DNA分析的家族成员的家系图示见补充图1a–f。

结果

通过免疫印迹法确认了每个变异及对照组的表达情况（见补充图2），随后在HEK-T293细胞和Flp-In? T-REx?细胞中分别进行了Ca²⁺释放测定，以评估瞬时和稳定表达情况。野生型和p.Thr4826Ile突变体在这两个系统中的EC₅₀值相当（见补充图3和补充表2）。已有报道指出p.Arg533Cys和p.Thr2787Ser变异的表达情况。

讨论

所有六个RYR1基因变异（p.Gln464Lys、p.Asp2431Val、p.Val2354Met、p.Ser2542Asn、p.Val2627Leu和p.Pro4973Leu）在使用Flp-In? T-REx?细胞或HEK-293T细胞的Ca²⁺释放测定中均表现出对RyR1激动剂4c-m-c的过度敏感性。使用野生型和p.Thr4826Ile突变体的对照研究结果表明，这两种系统都能有效区分野生型RYR1和过度敏感的RYR1变异。

p.Gln464Lys变异位于...

作者贡献

数据收集和图表制作：AHS、SMB、RA

数据分析：AHS、SMB、RA、LRvdB、KMS

初稿审阅：AHS、SMB、RA、LRvdB、RGM、MP

患者临床数据提供：TB

新西兰患者的IVCT检测：RGM

澳大利亚新南威尔士州患者的临床数据提供：MP、NS

澳大利亚新南威尔士州的基因分析：MP

研究构思、初稿撰写及最终提交前的修改：KMS

资助

澳大利亚和新西兰麻醉师学院（向AHS提供的20/001号资助）；Maurice & Phyllis Paykel信托基金（向AHS提供的193123号项目和设备资助）。

利益声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Keisaku Sato构建了全长野生型RYR1 cDNA克隆，以及Jeremy Stephens、Cornelia Roesl、Natisha Magan、Lili Rhodes和Ruth White在RYR1变异克隆工作中的帮助。AUS3/UK家族部分的IVCT和基因分型工作由Phil Hopkins、Nickla Fisher和Catherine Daly（英国利兹圣詹姆斯大学医院恶性高热科）完成。