肽辅助的脂质体转染技术能够高效地实现大规模CRISPR/Cas9基因组编辑构建体的非病毒递送

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Peptide-assisted lipofection enables efficient non-viral delivery of large CRISPR/Cas9 constructs for genome editing applications

高效安全的CRISPR/Cas9大基因递送系统PAL通过融合肽增强脂质体稳定性、靶向细胞摄取和高效内体逃逸，在HEK293T细胞中实现98.7%转染效率，细胞存活率提升至94-104%，并成功实现肝脏靶向递送和持续表达。

　　
韩国国立仁川大学生物工程系Byeong Hee Hwang、Gang Bao和Yeong Chae Ryu团队近期开发了一种新型非病毒基因递送系统——多肽辅助脂质体递送技术（PAL）。该系统通过融合工程化多肽与脂质体技术，成功解决了大片段基因载体递送效率低、细胞毒性高和体内稳定性差等长期困扰基因治疗领域的技术瓶颈。

在体外实验中，PAL系统展现出突破性性能。针对9283bp的CRISPR/Cas9质粒，PAL在HEK293T细胞中的转染效率达到98.7%，显著超越传统电穿孔（EP）方法的50.1%和常规脂质体转染效率。特别值得注意的是，当递送2.9万bp的MasterE质粒时，PAL仍能保持86.7%的转染效率，而EP仅达到54.3%。这种高效性源于三个关键机制：首先，TAP肽的阳离子特性（+11.66mV）有效中和质粒DNA的负电荷，形成稳定的复合体，其粒径分布在1000-1500nm范围内，完美适配细胞膜孔径；其次，TAP肽通过促进内吞体膜曲率改变，增强细胞摄取效率达4.8-43.4倍；再次，该多肽复合物在细胞内可自主逃逸内体，通过核定位信号（NLS）实现高效核定位，即使在细胞周期停滞状态下仍能保持2.3倍于裸DNA的转染效率。

体内实验进一步验证了系统的优势。在小鼠模型中，经肝内注射的PAL-Cas9复合体在72小时内仍能维持稳定荧光表达，其荧光强度是裸DNA递送系统的1.6倍。组织学分析显示，PAL组小鼠真皮组织未出现明显炎症反应或纤维化改变，而传统电穿孔组细胞存活率骤降至30.3%。值得注意的是，PAL系统在非增殖细胞（如皮肤成纤维细胞）中仍能保持94%以上的细胞活力，其NLS功能模块成功克服了核膜转运的物理障碍。

该系统的创新性体现在三个层面：1）电荷屏蔽技术，通过多肽-脂质体协同作用形成电荷梯度缓冲带，使DNA电离损伤降低72%；2）动态物理结构，复合体在血清环境中可自适应分解为1000nm以下微颗粒，既保持DNA完整性又增强细胞穿透力；3）双通路递送机制，既利用细胞天然内吞路径，又通过NLS实现核直接转运，使递送效率提升至传统方法的3-5倍。

在基因编辑领域，PAL系统展现出革命性突破。针对PLK1和BCL2基因的编辑实验显示，PAL介导的基因编辑效率达44.1%，是常规脂质体递送系统的2倍以上。通过TIDE（追踪插入/缺失）分析发现，PAL组在HeLa细胞中的平均编辑率提升至13.4%-17.2%，显著高于对照组（8.5%-3.5%）。更值得关注的是，该系统成功实现CRISPR/Cas9介导的转录沉默，在mCherry基因敲除实验中，荧光强度降低幅度达25%-46%，验证了其精准的基因调控能力。

临床转化潜力方面，PAL系统展现出三大优势：1）生产成本降低80%，通过简化脂质体制备流程和规模化生产实现；2）递送容量扩展至29kb，可同时编码Cas9蛋白与3个靶向不同基因的crRNA；3）生物相容性显著提升，动物实验显示经皮注射后72小时局部炎症反应指数（GIS）仅为0.8，而传统电穿孔组高达3.2。这些特性使其特别适合开发治疗遗传性眼病、代谢综合征等需要长期表达基因的治疗方案。

当前研究仍存在需要深化探索的领域：1）长期体内递送稳定性需通过12个月慢性毒性实验验证；2）跨器官递送效率差异需进一步优化载体粒径分布；3）非编码RNA递送系统的适配性仍待研究。团队计划在以下方向进行突破：开发温度响应型脂质体实现器官靶向；构建多模态递送系统整合mRNA和蛋白药物；建立标准化递送效果评价体系。

该技术的临床转化将显著降低基因治疗成本，提高操作安全性。根据现有数据推算，若应用于临床，可使CRISPR/Cas9基因编辑的循环肿瘤细胞捕获效率提升3倍，为实体瘤治疗提供新思路。同时，其多基因协同递送能力为复杂遗传病（如囊性纤维化）的联合治疗开辟了新路径，相关技术专利已进入国际PCT阶段。