《Behavioural Brain Research》：Advanced age and lipopolysaccharide influence behavioral and neurodegenerative features in LRRK2 G2019S knock-in mice
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帕金森病（PD）的神经退行性变化与衰老、遗传（如LRRK2 G2019S突变）及环境毒素（如LPS）的交互作用有关。本研究通过给G2019S敲入小鼠和野生型小鼠注射LPS，分析年龄与基因型的交互效应。结果显示，老年G2019S突变小鼠更易出现炎症反应（WAVE2、CXCR1蛋白升高）、行为缺陷（筑巢能力下降、活动减少）及SNc多巴胺能神经元显著丢失，提示该突变可能通过调控衰老相关炎症加速神经 degeneration。
阿努鲁帕·迪内什（Anuroopa Dinesh）|特蕾莎·福廷（Teresa Fortin）|孙宏宇（Hongyu Sun）|肖恩·海利（Shawn Hayley）
卡尔顿大学神经科学系，加拿大安大略省渥太华Colonel By Drive 1125号，邮编K1S 5B6
摘要
帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，据认为其发病与年龄增长、遗传易感性以及可能的环境毒素暴露共同作用有关。LRRK2基因的G2019S点突变是与PD最相关的遗传因素，已有研究表明该突变在啮齿动物中具有年龄依赖性效应，并且与神经炎症过程相关。因此，本研究的目的是利用细菌内毒素脂多糖（LPS）来阐明高龄与免疫系统激活在G2019S敲入小鼠及其野生型同窝小鼠中的相互作用。将3-4个月大的成年小鼠和9-12个月大的老年小鼠每隔一天腹腔注射250毫克/千克的LPS（或生理盐水）。在多种行为结果中均观察到年龄、基因型和注射之间的显著交互作用。具体而言，老年G2019S小鼠对LPS注射更为敏感，表现为疾病反应增强、筑巢行为缺陷、体重下降以及活动能力长期减弱。这些小鼠还表现出SNc区炎症小胶质细胞蛋白（WAVE2和CXCR1）的变化，并且黑质多巴胺神经元损失最为严重，这与帕金森病的表型特征一致。综上所述，我们的数据表明LRRK2 G2019S突变可能是调控衰老和炎症过程的关键因素，而这些过程对神经退行性病变以及运动和非运动症状都具有重要影响。
引言
帕金森病（PD）是一种与年龄相关的进行性疾病，其特征是黑质致密部（SNc）多巴胺（DA）神经元逐渐丧失，导致运动迟缓、静止性震颤、肌肉僵硬和姿势不稳[1][2]。越来越多的证据表明神经炎症在SNc神经元退化及PD症状出现中起着重要作用[3][4][5][6][7]。实际上，病毒和细菌感染已被证实会导致啮齿动物出现SNc退化[87][88][89][90]。特别是细菌内毒素脂多糖（LPS）在疾病模型中被广泛用于诱导DA神经元病变和小胶质细胞活化[8][9][10][11]。此外，有理由认为SNc区域比大脑其他区域更容易受到LPS和高龄的影响[12][13]。
大量临床研究关注LRRK2（富含亮氨酸重复序列的激酶2）基因及其与家族性和特发性PD的关联，多项动物实验（包括我们的研究）也表明敲除或抑制LRRK2可在PD模型中产生保护作用[14][15]。LRRK2蛋白的生理功能主要源于其两个酶活性结构域：激酶结构域（催化磷酸化反应）和ROC-GTPase结构域（GTP-GDP水解反应）[16]。研究还发现LRRK2参与小胶质细胞和周围免疫细胞的活化与成熟过程[17][18]，LPS暴露后小胶质细胞中的LRRK2表达水平升高[19][20]。相应地，下调LRRK2表达可减少LPS诱导的促炎细胞因子和NF-κB（先天性和适应性免疫反应的主要转录因子）[21][22][23]。
最常见的LRRK突变是G2019S，该突变发生在激酶激活序列的起始位置，导致甘氨酸取代丝氨酸，约占家族性PD病例的5-6%和散发性PD病例的1-2%[24][25]。由于G2019S位于一个构象灵活的激活环区域，这种丝氨酸到甘氨酸的替换改变了该区域的灵活性，使其固定为活跃构象[26]。因此，LRRK2 G2019S敲入（KI）小鼠表现出增强的激酶活性以及随年龄增长的线粒体功能障碍[27]。越来越多的证据表明G2019S突变会加剧神经炎症过程[28][29]。例如，在表达G2019S LRRK2的啮齿动物中，SNc内注射LPS会引发过度的炎症反应和神经退行性病变[19]。我们的研究也发现，G2019S KI小鼠对LPS引起的疾病和运动行为反应更为敏感，这与炎症反应增强有关[31]。我们还发现LRRK2可通过小胶质细胞特异性肌动蛋白调节蛋白Wiskott-Aldrich综合征家族Verprolin同源蛋白-2（WAVE2）来调节小胶质细胞的炎症反应[76]。实际上，LRRK2对WAVE2的激活影响小胶质细胞的形态、迁移能力、吞噬反应以及氧化自由基的释放[76]。此外，调节小胶质细胞趋化性的趋化因子CX3CR1也与LRRK2信号传导相关[77][78]。
基于帕金森病的多因素致病机制，我们评估了LPS与高龄联合使用时对G2019S KI小鼠的影响。除了PD的核心运动症状外，还出现了多种非运动症状，包括抑郁、焦虑、疲劳、体重下降、胃肠道紊乱、嗅觉障碍和动机障碍[32]。这些症状在暴露于LPS或病毒等炎症刺激的人类或动物中也可能出现或受到影响[33][34]。类似地，高龄也可能影响这些症状。因此，我们检测了SNc多巴胺能神经元的存活情况、WAVE2和CX3CR1的水平，以及与运动功能相关的行为，还包括伴随PD和/或炎症相关疾病出现的疾病反应和动机变化。
实验动物
本研究共使用了80只C57BL6/J背景的雄性G2019S KI小鼠，这些小鼠通过杂合子繁殖获得（基因型为LRRK2 G2019S KI和野生型）。每笼最多饲养4只小鼠，饲养环境保持恒定温度和湿度，光照/黑暗周期为12小时/天。小鼠可自由摄取食物（Harlan Labs 2014啮齿动物饲料）和饮水。实验开始前一周，每只小鼠单独饲养，并提供巢材。
体重变化
图3A显示了第一次、第三次和第五次LPS注射后的体重变化。首次LPS注射后48小时，年龄、基因型和注射之间的三因素交互作用显著（F1,69 = 13.01，p = 0.001）。老年小鼠在接受LPS处理后体重显著下降，尤其是在G2019S突变小鼠中这种下降更为明显（p < 0.05）。第三次注射后的体重变化（图3B）也显示出年龄和注射之间的显著交互作用。
讨论
年龄是帕金森病发展的最显著风险因素，多巴胺神经元的功能会逐渐丧失并最终死亡[40][41]。LRRK2 G2019S突变可能通过增强激酶活性加速这种与年龄相关的功能衰退[42][43]。大量证据表明，G2019S突变本身仅在高龄时才会表现出相关表型[45]。
作者声明
所有作者均已审阅并同意提交的手稿最终版本。
CRediT作者贡献声明
阿努鲁帕·迪内什（Anuroopa Dinesh）：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析。
特蕾莎·福廷（Teresa Fortin）：结果验证、实验监督、方法学指导。
孙宏宇（Hongyu Sun）：项目监督、资金筹集、概念构思。
肖恩·海利（Shawn Hayley）：撰写与编辑、初稿撰写、实验监督、资源调配、资金筹集、概念构思。
