轴突起始段特异性PP2A-B55γ亚基通过调控Kv1.2磷酸化调节神经元兴奋性的新机制

《Nature Communications》：A distinct PP2A subunit regulates local protein phosphorylation at the axon initial segment

本研究针对轴突起始段(AIS)局部蛋白磷酸化调控机制不清的问题，揭示了PP2A磷酸酶B55调控亚基Ppp2r2c通过其独特的“缺口”β-螺旋桨结构特异性富集于AIS，并利用微电极阵列和磷酸化蛋白质组学技术发现Ppp2r2c通过调控钾离子通道Kv1.2的S440/441位点磷酸化水平影响神经元兴奋性，为理解AIS磷酸化调控及相关神经系统疾病提供了新视角。

　　

在神经元中，轴突起始段（AIS）是动作电位产生的关键区域，被称为神经元的“命令中心”。这个微域富含细胞骨架蛋白、离子通道和粘附分子，其功能受到蛋白质磷酸化的精密调控。磷酸化如同一个分子开关，通过添加或去除磷酸基团来调节蛋白质的活性、相互作用和定位。尽管蛋白激酶如CK2和GSK3β在AIS的功能已被部分揭示，但负责去磷酸化的蛋白磷酸酶，特别是那些特异性定位于AIS的磷酸酶，仍然是一个巨大的知识盲区。这种认知上的空白严重阻碍了我们对AIS如何动态调控神经元信号输出，以及在神经系统疾病中AIS功能紊乱机制的理解。

蛋白磷酸酶2A（PP2A）是细胞内最重要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶之一，它通常由结构亚基（A）、催化亚基（C）和调节亚基（B）共同组成三聚体全酶。其中，B55家族调节亚基（由Ppp2r2基因编码）负责决定PP2A全酶的底物特异性和亚细胞定位。然而，由于B55亚基存在多个旁系同源物（如Ppp2r2a, Ppp2r2b, Ppp2r2c）以及复杂的可变剪接，这些亚基在神经元中的精确分布和独特功能长期以来笼罩在迷雾之中。近年来，探索性蛋白质组学研究在AIS的蛋白质列表中发现了PP2A的一个B55调节亚基——Ppp2r2c（PP2A-B55γ）的踪迹，这暗示了特定PP2A-B55亚基与AIS之间可能存在先前未被认识的联系，为领域内提出关于它们在神经元信号传导中功能的新假设提供了前提。

本研究由美国贝勒医学院的Yudong Gao团队主导，发表在《Nature Communications》上。研究人员综合运用了多种前沿技术，包括CRISPR介导的基因编辑、同源独立性通用基因组工程（HiUGE）蛋白质标记、预测性蛋白质结构建模（AlphaFold）、磷酸化蛋白质组学、微电极阵列（MEA）记录、免疫共沉淀以及超高分辨率显微镜（STED）等，旨在阐明Ppp2r2c在小鼠AIS的定位机制和功能。

研究首先确认了PP2A-B55亚基在亚细胞定位上存在显著异质性。通过HiUGE技术对内源性蛋白进行荧光标记，以及病毒介导的重组蛋白表达，研究人员发现Ppp2r2c和Ppp2r2b的经典亚型特异性地富集在AIS，而Ppp2r2a则弥散分布在胞质中。这种富集依赖于AIS的核心支架蛋白Ankyrin-G (AnkG)。

为了揭示不同亚基定位差异的结构基础，研究人员利用AlphaFold预测了蛋白质结构。他们发现了一个关键特征：AIS富集的Ppp2r2b和Ppp2r2c拥有一个“缺口”的β-螺旋桨结构。具体而言，Ppp2r2a的N端与C端互锁，形成了一个完整的7叶β-螺旋桨；而Ppp2r2b/c的N端则未折叠并延伸出来，导致其β-螺旋桨结构上存在一个“缺口”。通过一系列截断和N端序列互换实验，研究证实正是这个“缺口”结构域驱动了Ppp2r2c在AIS的富集。将Ppp2r2a的N端截除后，原本弥散分布的Ppp2r2a突变体获得了在AIS富集的新能力，反之，破坏Ppp2r2c的“缺口”结构则使其丧失AIS定位能力。

在功能层面，利用微电极阵列系统记录体外培养神经元的网络活动，研究人员发现CRISPR介导的Ppp2r2a或Ppp2r2c敲低均会降低神经元的平均放电率、爆发频率和网络爆发频率。然而，当过表达这些亚基时，只有定位于AIS的Ppp2r2c的过表达能显著增强神经元网络的活性，而弥散分布的Ppp2r2a过表达则无此效果。更重要的是，那个获得了AIS富集能力的Ppp2r2a突变体（ΔN26）在过表达时也能像Ppp2r2c一样增强神经元活性。这强有力地证明，PP2A-B55亚基在AIS的定位是其调节神经元兴奋性的关键决定因素。

那么，Ppp2r2c是通过调控哪些底物来影响神经元活性的呢？研究人员通过磷酸化蛋白质组学分析给出了答案。比较Ppp2r2a过表达和Ppp2r2c过表达条件下的磷酸化肽段，他们发现两者下调的磷酸化位点重叠很少，体现了PP2A调节亚基的功能异质性。基因本体（GO）分析显示，Ppp2r2c过表达主要影响“轴突起始段”和“结旁区”相关的蛋白质磷酸化。在众多候选靶点中，钾离子通道Kv1.2（由Kcna2基因编码）的S440/441位点的磷酸化水平在Ppp2r2c过表达后显著降低。已知该位点的磷酸化对Kv1.2通道的膜运输和功能表达至关重要。

进一步的实验验证了Ppp2r2c与Kv1.2之间存在相互作用，并且Ppp2r2c过表达会导致AIS处Kv1.2的免疫反应强度显著降低，而电压门控钠通道（Na_V）的丰度则不受影响。这种对AIS离子通道组成的特异性调节——减少抑制性外向钾电流（Kv1.2）而不影响兴奋性内向钠电流（Na_V）——为Ppp2r2c过表达增强神经元兴奋性提供了合理的分子机制解释。

综上所述，这项研究揭示了PP2A磷酸酶的B55调节亚基在神经元中存在前所未有的亚细胞定位特异性。Ppp2r2c凭借其独特的“缺口”β-螺旋桨结构特异性地富集于轴突起始段，进而通过调控钾通道Kv1.2等底物的磷酸化状态来调节神经元的兴奋性。这项工作不仅鉴定出首个具有明确AIS富集特征的磷酸酶调节亚基，填补了AIS局部磷酸化调控知识的空白，而且为理解PP2A功能障碍如何通过影响AIS离子通道平衡进而参与自闭症谱系障碍（ASD）、智力残疾、双相情感障碍（BD）等神经发育疾病的病理过程提供了新的切入点。未来，进一步解析Ppp2r2c与其他AIS蛋白质的相互作用网络，以及在体研究其在特定神经元类型（如兴奋性 vs. 抑制性神经元）和疾病模型中的功能，将有助于更全面地揭示其在神经系统生理和病理中的核心作用。