核内机制在密码子使用偏好调控人类基因表达中的关键作用

《Nature Communications》：Nuclear effects play an important role in determining codon usage-dependent human gene expression

本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选发现，CCR4-NOT复合物亚基CNOT4及核RNA外泌体、PAXT复合物等核内因子通过调控转录和核内mRNA稳定性，介导密码子使用偏好对基因表达的影响，揭示了核苷酸组成依赖性基因表达调控的新机制，为理解真核生物基因表达进化提供了新视角。

　　

在分子生物学领域，密码子使用偏好长期以来被视为通过翻译相关过程调控基因表达的关键因素。然而，越来越多的证据表明，同义密码子的选择不仅影响翻译效率，还可能通过未知的核内机制影响基因表达水平。这一现象在人类细胞中尤为复杂，因为人类基因组具有较高的GC含量和特定的密码子使用模式。传统观点认为，密码子主要通过调控翻译延伸速度、核糖体暂停及共翻译mRNA降解等胞质过程来影响基因表达，但近期研究发现，密码子使用偏好与核内RNA水平存在显著相关性，提示存在翻译无关的核内调控机制。

为系统解析密码子使用偏好影响基因表达的具体机制，研究人员采用全基因组CRISPR-Cas9筛选技术，结合双报告基因细胞系，筛选出多个参与密码子使用依赖性基因表达的核内因子。研究发现，CCR4-NOT复合物亚基CNOT4、核RNA外泌体组分（如EXOSC2/4/7/8、DIS3）以及PAXT复合物（包含ZFC3H1、PABPN1、NCBP2等）在调控密码子使用依赖性基因表达中发挥关键作用。

关键技术方法包括：1）构建含不同密码子使用偏好的双荧光报告基因细胞系；2）全基因组CRISPR-Cas9筛选及验证实验；3）核运行测序（GRO-seq）和RNA测序分析；4）细胞组分分离及RT-qPCR检测；5）RNA免疫共沉淀分析蛋白-RNA相互作用。

密码子使用与核内RNA水平在全基因组范围内相关

通过分析人类细胞中总RNA、核RNA及新生RNA（GRO-seq）数据，发现密码子适应指数（CAI）和GC含量与组成型表达基因的RNA水平呈显著正相关。密码子频率分析显示，G/C结尾的密码子与RNA水平正相关，而A/T结尾的密码子呈负相关。通过比较DNA转染与mRNA转染实验，发现核内效应对密码子使用依赖性基因表达的贡献远大于胞质效应。

全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定参与密码子使用效应的核内因子

利用双报告基因细胞系（wtGFP/opt-mCherry）进行筛选，发现CNOT4、核RNA外泌体组分（DIS3、EXOSC2/4/7/8）及PAXT复合物组分（ZFC3H1、PABPN1）等核内因子显著影响密码子使用依赖性基因表达。验证实验表明，敲低这些因子可特异性提高非最优密码子报告基因的表达水平。

CNOT4通过核内效应影响密码子使用依赖性基因表达

CNOT4主要定位于细胞核，其敲低显著提高非最优密码子报告基因的核内RNA水平和转录活性，但对mRNA转染实验中的翻译效率无显著影响。全基因组分析显示，CNOT4敲低降低了基因GC含量/CAI与RNA水平的相关性，并优先上调富含非最优密码子的mRNA。

核RNA外泌体与PAXT复合物介导密码子使用依赖性基因表达

敲低PAXT复合物组分（ZFC3H1、PABPN1）可特异性提高非最优密码子报告基因的核内及胞质mRNA水平，并增加其胞质/核mRNA比率。核内mRNA降解实验表明，PAXT复合物优先促进富含非最优密码子的mRNA的核内降解。RNA免疫共沉淀证实PABPN1优先结合非最优密码子富集的mRNA。

PAXT复合物影响全基因组密码子使用依赖性mRNA定位

全基因组RNA测序分析显示，PAXT组分敲低显著降低了基因CAI/GC含量与胞质/核mRNA比率的相关性，表明其通过核内RNA质量控制途径调控密码子使用依赖性mRNA定位。

本研究揭示了CCR4-NOT复合物通过抑制富含非最优密码子基因的转录，而PAXT复合物通过促进这类mRNA的核内降解，共同调控密码子使用依赖性基因表达的新机制。这些发现表明，密码子使用偏好的进化不仅受翻译相关过程的选择压力，还受到核内转录、RNA质量控制等翻译无关过程的影响。研究为理解真核生物基因表达调控提供了新视角，并对疾病相关基因的表达调控具有重要启示意义。