单个体水平完成双翅目害虫橘小实蝇端粒到端粒基因组组装揭示性染色体演化与嗅觉基因扩张

《Nature Communications》：Telomere-to-telomere genome assembly of the Dipteran Bactrocera dorsalis from a single individual

本期推荐研究人员针对双翅目昆虫因个体小、DNA提取难、遗传背景复杂导致的基因组组装难题，创新性地利用单个体低输入PacBio HiFi CCS结合混合样本ONT测序策略，成功完成橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）596 Mb的T2T基因组组装，首次解析其着丝粒、端粒及性染色体完整结构，发现Y染色体特异性ATPsynβ基因及OR88a基因簇串联重复调控甲基丁香酚行为响应，为 Diptera 比较基因组学及害虫防控技术开发提供关键基因组资源。

　　

在农业害虫防控领域，双翅目昆虫（如果实蝇类）因其体型微小、遗传背景复杂及端粒/着丝粒结构保守性低，长期阻碍高质量基因组资源的获取。传统基因组组装需混合多个个体DNA，易引入单倍型冗余，难以实现端粒到端粒（T2T）的完整组装。橘小实蝇作为危害150余种水果作物的入侵性害虫，其基因组中性染色体结构、化学感受基因家族演化等关键问题尚未解析，制约了基于基因靶点的绿色防控技术研发。

本研究通过优化低输入PacBio HiFi CCS文库构建技术，对单只雄性橘小实蝇个体进行测序，结合近交群体混合样本的牛津纳米孔（ONT）长读长数据和Hi-C染色质构象捕获技术，采用多步骤拼接策略（包括污染物过滤、单元图验证、性染色体片段识别等），最终获得596.16 Mb的T2T级别基因组，包含5对常染色体和XY性染色体的无间隙组装。

关键方法概述

研究利用单只雄性橘小实蝇的PacBio HiFi CCS数据（19.55 Gb，平均读长12.34 kb）和近交群体混合样本的ONT数据（94.79 Gb）进行初步组装，通过比对细菌/真菌基因组去除污染序列，采用Hifiasm和HiCanu进行单元图构建，结合Hi-C数据辅助染色体挂载。着丝粒卫星单体（cenSats）通过TRF和RepeatMasker鉴定，性染色体通过覆盖度差异及FISH实验验证。嗅觉受体基因（ORs）通过隐马尔可夫模型和同源比对注释，利用CRISPR/Cas9对BdorOR88a基因簇进行敲除，并通过EAG（触角电位图）和四象限嗅觉仪验证行为变化。

Gapless T2T genome assembly of a male individual

通过对比雌雄个体HiFi CCS数据，选择雄性样本（污染率2.1%，低于雌性的14.31%）进行最终组装。组装完整性达99.38%（BUSCO评估），着丝粒和端粒区域实现无缝覆盖。与已发表基因组相比，本组装在着丝粒和性染色体区域一致性显著提升，首次揭示橘小实蝇着丝粒由BdoSat1（180 bp）、BdoSat2（166 bp）和BdoSat3（166 bp）三类卫星单体主导，其中BdoSat3特异性分布于性染色体。

Characteristics of candidate centromeres and telomeres

着丝粒高阶重复（HOR）结构呈现染色体特异性分布：BdoSat2富集于常染色体，BdoSat3集中于性染色体。端粒区域发现528 bp串联重复单元，而性染色体端粒嵌有rDNA阵列及逆转录酶基因，与近缘种Bactrocera oxeae的FISH结果一致。rDNA在XY染色体的聚集可能通过抑制重组维护性染色体结构稳定性。

Characteristics of nuclear-mitochondrial DNA segment (NUMT) insertions

在核基因组中鉴定出105个NUMT插入位点，聚类为11个线粒体同线性区块，主要分布于2号染色体和X染色体。较古老的NUMT拷贝呈现更高的GC含量和转座子插入，反映核基因组对外源序列的演化适应。

Characteristics of sex chromosomes and related gene expression

X染色体（67.73 Mb）和Y染色体（7.17 Mb）分别注释578和52个基因。Y染色体特异性基因BdoYG000019（ATPsynβ同源物）在雄性组织中高表达，可能支持求偶等耗能行为。性相关差异表达基因（DEGs）中，雄性特异性基因富集于能量代谢通路，与雄性长途迁徙和性信息素合成需求相符。

Phylogenetics and X chromosome evolution

基于22种双翅目物种的比较基因组学分析，发现橘小实蝇X染色体与黑腹果蝇4号染色体（Muller F）同源，支持双翅目性染色体多系起源假说。rDNA在性染色体的聚集可能是祖先特征，但其演化路径在各类群中具多样性。

T2T genome data facilitate functional genomics to develop molecular-target-based pest control techniques

注释110个嗅觉受体基因（ORs），其中69%以串联重复形式存在。BdorOR88a基因簇（3个成员）通过异构转录本生成增加功能可塑性，CRISPR/Cas9敲除实验表明其调控雄性对甲基丁香酚的趋化行为，但EAG响应未显著改变，提示存在其他嗅觉通路补偿。

结论与意义

本研究首次在双翅目害虫中实现单个体T2T基因组组装，突破了小昆虫DNA提取不足的技术瓶颈。完整着丝粒/端粒结构和性染色体解析为昆虫染色体演化提供新视角，Y染色体特异性ATPsynβ基因及OR基因簇扩张机制为害虫性控技术和行为干扰策略开发奠定理论基础。该基因组资源将推动Diptera比较基因组学研究，并为橘小实蝇的基因靶向防控提供精准分子工具。