厌氧相关多药外排泵MdtF的酸激活转运机制及其在细菌应激耐受中的结构基础

《Nature Communications》：Molecular basis for multidrug efflux by an anaerobic-associated RND transporter

本研究针对细菌在厌氧、酸性等胁迫环境下多重耐药性增强的临床挑战，聚焦大肠杆菌MdtEF-TolC外排泵的核心转运蛋白MdtF。研究人员通过冷冻电镜结构解析、分子动力学模拟及功能实验，首次揭示了MdtF在天然脂质环境中的不对称转运机制，发现其跨膜区构象变化受限但具有酸激活特性，并阐明单点突变V610F通过形成疏水凹槽改变底物特异性。该研究为理解细菌在胃肠道等胁迫环境中适应性耐药提供了分子机制见解，对针对应激条件下RND转运泵的抑制剂开发具有重要指导意义。

　　

在抗生素耐药性日益严峻的全球健康危机中，细菌通过过量表达外排泵这一巧妙机制来抵御抗生素攻击。其中，耐药结节化细胞分裂（Resistance-Nodulation-Division, RND）超家族转运蛋白在革兰氏阴性菌的多重耐药性中扮演关键角色。当细菌面临缺氧、营养匮乏或酸性环境等生态压力时，大肠杆菌中的MdtEF-TolC外排泵表达量会急剧上升，但其分子工作机制长期以来笼罩在迷雾之中。

近日发表于《Nature Communications》的研究首次揭示了MdtF转运蛋白的工作奥秘。为了解开这一谜题，研究团队采用多学科交叉方法：通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了在天然脂质纳米盘（SMALPs）中的MdtF三维结构，包括野生型、V610F突变体及底物结合状态；利用分子动力学模拟分析蛋白质构象变化；通过荧光偏振实验测定底物结合亲和力；采用尼罗红外排实验评估泵功能活性；并利用最小抑菌浓度测定验证突变体的耐药表型变化。

Cryo-EM结构揭示MdtF的功能旋转机制

研究人员首先在天然脂质环境中解析了MdtF的冷冻电镜结构，发现其与经典AcrB转运蛋白具有相似的不对称三聚体构象，但在跨膜区域存在显著差异。

特别值得注意的是，MdtF的访问状态已经具有类似结合状态的“摆动出”构象，这种固定的跨膜构型可能影响其能量转换效率。

药物结合域可塑性决定MdtF药物特异性

对V610F突变体的研究发现，该单点突变在远端结合口袋（DBP）形成了一个“疏水凹槽”，改变了底物识别特性。分子动力学模拟显示，与AcrB相比，MdtF的PC1-PC2裂隙在访问状态下更为闭合，可能偏好通过通道3（CH3）进行底物转运。

MdtF泵特性由其质子中继相关运动定义

研究发现MdtF的质子中继网络残基D407、D408、K938和R969的相互作用模式与AcrB存在差异，D407在MdtF中表现出更高的参与度。

功能实验证实，与AcrB相比，MdtF在中性pH条件下的外排效率较低，但其活性在酸性环境下显著增强。

MdtEF药物转运效率对pH响应

研究人员发现MdtEF的活性具有显著的pH依赖性，在酸性条件下外排效率大幅提升。

这一特性与MdtF在厌氧、酸性环境中的上调表达模式相吻合，表明其是细菌适应胃肠道等胁迫环境的重要适应性机制。

该研究系统阐明了MdtF在分子水平的工作机制，揭示了其独特的酸激活外排特性。这一发现不仅深化了对RND外排泵功能多样性的理解，还为针对胁迫条件下细菌耐药性的新型抑制剂设计提供了理论基础。特别是在CFA（环丙烷脂肪酸）重塑的内膜环境中，MdtEF-TolC系统能够为细菌提供多层次的防御机制，这一认识对控制胃肠道感染中的细菌适应性耐药具有重要意义。研究揭示的构象可塑性与质子中继网络协同工作机制，为未来针对细菌应激反应通路的新型抗菌策略开发指明了方向。