新型BRET生物传感器：在活细胞中精准测量PRMT5复合物的非竞争性靶向 engagement

《Nature Communications》：A BRET biosensor for measuring uncompetitive engagement of PRMT5 complexes in cells

本刊推荐：为解决在活细胞内直接评估PRMT5（蛋白精氨酸甲基转移酶5）非竞争性靶向 engagement 的技术空白，研究人员开发了名为CBH-002的BRET生物传感器。该探针可动态监测细胞内SAM/MTA库，实现对PRMT5抑制剂三元复合物形成机制的活细胞定量分析，为MTAP缺失癌症的精准治疗提供新工具。

　　

在癌症治疗领域，蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）已成为一个备受关注的治疗靶点。这种酶通过催化组蛋白和非组蛋白的精氨酸残基对称二甲基化，在转录调控、核小体重塑等关键细胞过程中发挥重要作用。特别值得注意的是，在约10-15%的人类癌症中，甲基硫腺苷磷酸化酶（MTAP）基因的缺失导致甲基硫腺苷（MTA）在细胞内积累，这为通过选择性靶向PRMT5实现合成致死提供了独特的机会。

然而，当前PRMT5抑制剂的研究面临一个重大技术挑战：虽然非竞争性靶向 engagement（uncompetitive engagement）可以在无细胞系统中进行评估，但尚无方法能够直接在活细胞中进行这种评估。这种技术空白限制了我们全面理解PRMT5抑制剂在生理相关环境中的作用机制，特别是对于那些与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）或其抑制性代谢前体MTA形成三元复合物的抑制剂。

为了解决这一难题，牛津大学和Promega公司的联合研究团队在《Nature Communications》上报道了一种新型BRET（生物发光共振能量转移）生物传感器，能够直接监测活细胞内PRMT5复合物的非竞争性靶向 engagement。研究人员基于PRMT5抑制剂GSK3326595（pemrametostat）的结构，设计并合成了胺功能化类似物CBH-001，进而开发出BRET兼容探针CBH-002。这种新型探针对细胞内SAM/MTA库高度敏感，能够克服当前竞争性结合分析的局限性。

关键技术方法包括：基于GSK3326595支架设计BRET兼容探针CBH-002；利用化学蛋白质组学和2D热分析验证探针特异性；建立表达NanoLuc-PRMT5融合蛋白的HEK293和HCT116细胞系；开发活细胞NanoBRET靶向 engagement 检测方法；通过MTA滴定和MAT2A抑制实验评估代谢物敏感性；使用MTAP野生型和敲除的HCT116结直肠癌细胞模型验证病理相关性。

BRET探针CBH-002的开发与验证

研究人员首先通过化学蛋白质组学实验验证了CBH-001能够有效富集内源性PRMT5蛋白及其复合物伙伴WDR77（MEP50）。Western blot和质谱分析表明GSK3326595对其认知靶标具有高度特异性。随后合成的BRET兼容探针CBH-002在共表达未标记WDR77 DNA的HEK293细胞中显示出强烈的特异性BRET信号。

有趣的是，当PRMT5单独表达时，BRET剂量反应曲线呈现双相性，而共表达WDR77后，这种双相行为得到缓解，产生单一结合等温线。这表明在WDR77饱和水平下，更高阶的甲基转移酶复合物更易形成。CBH-002对PRMT7、PRMT9或非甲基转移酶蛋白如RIPK2和BDR9没有显著活性，表明其对PRMT5具有良好的选择性。

CBH-002对所有PRMT5靶向 engagement 模式的敏感性

研究人员评估了一系列PRMT5抑制剂在CBH-002竞争性置换分析中的表现。令人惊讶的是，CBH-002能够检测所有目前已报道的PRMT5 engagement 模式。GSK3326595和EPZ015666的NanoBRET结合效力分别为20 nM和27 nM，与Western blot和细胞增殖数据基本一致。

LLY-283和PF-06939999的效力分别为467 nM和1.7 nM，也与已发表的细胞分析数据相符。底物竞争性BRET探针对共底物竞争性抑制剂（如LLY-283）的敏感性支持了这些结合位点之间存在变构通讯的观点。此外，CBH-002对MRTX1719和TNG908等被指定为MTA协同性的抑制剂也具有敏感性。

CBH-002对细胞内SAM/MTA水平的敏感性

基于SAM和MTA协同性PRMT5抑制剂的作用机制报道，细胞内SAM/MTA库的调节应直接影响靶向 engagement 的药理学。研究人员发现BRET生物传感器对[SAM]高度敏感，在约两个数量级范围内呈现线性响应。

通过MAT2A抑制调节SAM生物合成途径的实验进一步证实了CBH-002对细胞内SAM水平的敏感性。与SAM促进CBH-002结合相反，MTA在功能上应与BRET探针结合竞争。外源性MTA滴定实验显示，CBH-002能够检测共底物口袋中MTA的变构结合。

测量细胞内MTA非竞争性PRMT5靶向 engagement

结构和生化证据支持MRTX1719及相关化学型具有正MTA协同性和三元复合物形成能力。研究人员利用CBH-002量化MTA水平对PRMT5靶占据的影响，这是BRET技术直接探测内源性代谢物促进特异性药物-靶标相互作用的独特应用。

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研究发现，MTA水平对每种亚型效力的影响差异很大。共底物竞争性抑制剂如LLY-283和PF-06939999随着外源性MTA的增加表现出效力右移，符合竞争性结合模式。SAM非竞争性抑制剂EPZ015666和GSK3326595在外源性MTA处理下表现出适度的效力右移（3-4倍）。相比之下，MTA处理使MRTX1719和TNG908对PRMT5的亲和力提高了一个数量级以上。

在MTAP敲除细胞中调查PRMT5-MTA复合物的合成致死性 engagement

MTA非竞争性抑制剂在不同MTAP缺失癌细胞系中表现出广泛的效力范围。研究人员在更病理生理相关的环境中测量了抑制剂的靶向 engagement。HCT116 MTAP野生型和MTAP^-/-结直肠癌细胞作为同基因对，已成为基准合成致死PRMT5抑制剂的模型系统。

-/-细胞中的代表性浓度曲线；D,E HCT116 MTAP野生型细胞中MTA和MRTX1719的滴定矩阵。'>

在HCT116同基因对中，CBH-002效力与HEK293相当，表明这些细胞模型中的细胞内SAM水平相似。与预期一致，MRTX1719与PRMT5的结合在HCT116 MTAP^-/-细胞中比野生型细胞更强（EC₅₀ = 5.9 nM对比EC₅₀ >1μM）。值得注意的是，这些结果与先前在同基因对中的表型分析非常一致，表明MTA非竞争性抑制剂的靶向 engagement 在此类细胞类型中与明显的抗增殖效应相称。

研究结论与意义

该研究开发的CBH-002 BRET生物传感器代表了PRMT5研究领域的重大突破。这种新型工具能够直接在活细胞环境中量化所有三类PRMT5抑制剂的靶向 engagement，包括之前难以评估的MTA非竞争性抑制剂。

更重要的是，这种BRET系统能够评估代谢物水平对药物效力的影响，为理解PRMT5抑制剂在不同细胞背景下的选择性提供了新视角。研究发现，即使是在遗传定义明确的背景下，PRMT5的脆弱性也可能受到SAM、MTA和其他代谢中间体不同水平的影响，这解释了为什么MTA协同性抑制剂在不同细胞系中表现出不同的效力。

该方法不仅有助于优化现有PRMT5抑制剂，还为开发新一代MTA非竞争性PRMT5抑制剂提供了强大的筛选工具。在精准医疗时代，这种能够直接评估代谢物依赖性靶向 engagement 的技术对于开发针对MTAP缺失癌症的个性化治疗方法具有重要意义。

该研究的创新性在于首次实现了活细胞内PRMT5非竞争性靶向 engagement 的直接测量，突破了传统BRET方法仅限于竞争性结合分析的局限性。通过将BRET技术应用于代谢物依赖性药物靶标相互作用的定量分析，这项工作为化学生物学和合成致死药物发现领域提供了重要的方法论进步。