USP16 S-硝基化通过抑制KDM1A介导的谷胱甘肽稳态加重冠状动脉微栓塞所致心肌损伤

《Nature Communications》：USP16 S-nitrosylation aggravates coronary microembolization-induced myocardial injury via repressing KDM1A-mediated glutathione homeostasis

本研究针对冠状动脉微栓塞(CME)诱发心肌损伤的机制展开深入探索，发现USP16在C731位点的S-硝基化(SNO)通过抑制其对KDM1A的去泛素化作用，导致KDM1A蛋白降解，进而影响KDM1A对GCLM和GLS的表观遗传调控，破坏谷胱甘肽(GSH)稳态，最终加剧CME诱导的心肌损伤。该研究揭示了CME进程中氧化应激调控的新机制，为临床干预提供了潜在靶点。

　　

在心血管疾病领域，冠状动脉微栓塞(CME)是一种严重但常被忽视的并发症。它可能由动脉粥样硬化斑块碎片自发脱落引起，也可能是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的并发症。CME会导致冠状动脉血流储备降低、心功能不全和心律失常，是心血管不良事件的重要预测因子。目前临床治疗策略主要集中在斑块稳定化以及使用血管扩张剂、抗血小板和抗炎药物，但疗效有限。因此，深入理解CME导致心肌损伤的分子机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

先前研究表明，谷胱甘肽(GSH)耗竭诱导的氧化应激是CME的关键驱动因素。GSH是细胞内最重要的抗氧化剂之一，其稳态平衡对于抵抗氧化应激损伤至关重要。GSH合成受一系列酶调控，包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLM)和谷氨酰胺酶(GLS)。然而，在CME诱导的心肌损伤过程中，GSH失衡的具体调控机制尚不完全清楚。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，由苏强、秦姣芹、黄元等人合作完成，深入揭示了CME诱导心肌损伤的新机制：USP16的S-硝基化通过抑制KDM1A介导的GSH稳态，从而加重心肌损伤。

研究人员为开展此项研究，综合运用了多种关键技术方法。研究建立了大鼠CME模型，并通过尾静脉注射AAV9病毒实现心脏特异性基因过表达。利用超声心动图评估心功能，采用HE染色、HBFP染色和TUNEL染色进行组织病理学分析。体外实验使用缺氧处理的H9c2心肌细胞和原代新生大鼠心室肌细胞(NRVMs)模拟CME。通过蛋白质印迹、免疫组化、RT-qPCR、Co-IP、ChIP等技术分析蛋白表达、互作和表观遗传调控。采用CCK-8法检测细胞活力，生化法测定GSH/GSSG比值和ROS水平。通过生物素转换实验检测S-硝基化水平，并利用质谱分析鉴定互作蛋白和修饰位点。

CME破坏大鼠心功能和GSH稳态

研究人员首先成功建立了大鼠CME模型。超声心动图显示，CME大鼠的左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期容积(LVESV)和左心室舒张末期容积(LVEDV)均增加，表明CME诱导了心脏肥大。同时，射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)降低，表明心功能受损。血清CK-MB水平显著升高。组织学分析显示，CME大鼠心肌缺血区域增加，心肌细胞核溶解或缺失，伴有水肿和大量炎症细胞浸润，细胞凋亡增加。重要的是，CME诱导后，心肌组织中GCLM和GLS表达降低，GSH/GSSG比值下降，ROS水平升高，表明GSH稳态被破坏。

GCLM/GLS过表达恢复体外CME模型中的GSH稳态

在体外，研究人员用缺氧心肌细胞模拟CME。随着缺氧时间延长，心肌细胞中GSH/GSSG比值和细胞活力降低，ROS水平升高。与体内结果一致，GCLM和GLS蛋白水平随时间推移而降低，而GSS、GDH和GSR蛋白水平不受缺氧影响。在H9c2细胞和原代NRVMs中过表达GCLM或GLS，可逆转缺氧诱导的GSH/GSSG比值降低和ROS水平升高，恢复细胞活力。这些结果表明，GCLM或GLS过表达可缓解缺氧诱导的心肌细胞GSH失衡。

KDM1A过表达减轻CME诱导的心功能不全和GSH失衡

研究人员将关注点转向组蛋白去甲基化酶KDM1A。他们发现CME大鼠心肌组织中KDM1A表达显著降低。通过向CME大鼠注射AAV9-KDM1A过表达KDM1A，可有效改善心功能指标，降低血清CK-MB水平，减少心肌缺血区域、微梗死面积、病理改变和细胞凋亡。同时，KDM1A过表达逆转了CME诱导的KDM1A、GCLM和GLS蛋白表达降低，部分逆转了GSH/GSSG比值下降和ROS水平升高。这些结果揭示，KDM1A过表达通过恢复GSH稳态，改善了CME诱导的心肌损伤。

心肌细胞中CME触发的GSH失衡被KDM1A过表达缓解

在体外实验中，缺氧使心肌细胞KDM1A蛋白水平呈时间依赖性下降。KDM1A过表达可增强GCLM和GLS蛋白水平，部分抵消缺氧刺激心肌细胞中GSH/GSSG比值和细胞活力的降低以及ROS水平的升高。KDM1A过表达还逆转了缺氧刺激心肌细胞中KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平的降低。因此，KDM1A过表达在体外CME模型中也负责维持GSH稳态。

KDM1A促进心肌细胞中GCLM和GLS的转录和表达

为探讨KDM1A对GSH相关蛋白表达的影响，研究人员敲低了H9c2细胞和NRVMs中的KDM1A。发现只有GCLM和GLS的mRNA和蛋白水平在KDM1A敲低后明显降低。通过生物信息学预测和ChIP实验验证，KDM1A可直接结合GCLM和GLS启动子区域。KDM1A沉默后，其与GCLM和GLS启动子的结合减弱。ChIP-re-ChIP实验表明，KDM1A缺失抑制了心肌细胞中GCLM和GLS启动子上去除H3K9me1/2。综上所述，KDM1A直接结合GCLM和GLS启动子，通过去除H3K9me1/2促进其转录和表达。

USP16在体外CME模型中去泛素化KDM1A

鉴于KDM1A蛋白表达在CME中降低，研究人员进一步探讨了其具体机制。发现蛋白酶体抑制剂MG132而非自噬抑制剂CQ可部分逆转缺氧诱导的KDM1A下调，表明KDM1A通过泛素-蛋白酶体系统而非自噬降解。Co-IP显示，缺氧刺激的心肌细胞中KDM1A泛素化水平呈时间依赖性增加。CME大鼠心肌组织中KDM1A蛋白泛素化水平也增强。通过质谱分析筛选出KDM1A潜在的E3泛素连接酶和去泛素化酶，发现USP16(去泛素化酶)和RNF138(E3泛素连接酶)是候选分子。缺氧使心肌细胞USP16蛋白水平呈时间依赖性降低，而不影响RNF138蛋白水平。USP16敲低降低KDM1A蛋白水平，而RNF138敲低增强KDM1A蛋白水平。Co-IP验证了KDM1A与USP16/RNF138蛋白的外源性和内源性相互作用。在正常条件下，KDM1A倾向于结合USP16而非RNF138，这在缺氧条件下被逆转。因此，缺氧刺激下RNF138介导的泛素化导致KDM1A蛋白降解。

KDM1A在缺氧条件下在K355位点被泛素化

为进一步鉴定KDM1A蛋白的特异性泛素化位点，通过质谱分析筛选出K355位点。Co-IP实验显示，在缺氧条件下，KDM1A-K355R组的KDM1A泛素化水平低于KDM1A-WT组。USP16敲低增强了缺氧刺激的H9c2细胞中KDM1A-WT组的KDM1A泛素化水平，而在KDM1A-K355R组中这种效应被消除。K355位点突变增强了H9c2细胞中的GSH/GSSG比值和细胞活力，降低了ROS水平。USP16缺失降低了KDM1A-WT转染的H9c2细胞的GSH/GSSG比值和细胞活力，增加了ROS水平，而这些变化在K355位点突变后被消除。USP16敲低降低了缺氧暴露的H9c2细胞KDM1A-WT组中KDM1A、GCLM和GLS的蛋白水平，但不影响KDM1A-K355R组。这些结果证明USP16抑制KDM1A蛋白在K355位点的泛素化。

抑制C731位点的SNO-USP16改善CME模型中的GSH稳态

S-硝基化(SNO)是一种基于氧化还原的蛋白质修饰，调节多种酶的生物学功能。生物素转换实验显示，CME大鼠心肌组织中SNO-USP16水平显著高于假手术组。缺氧刺激的心肌细胞中SNO-USP16水平也升高。GPS-SNO数据库预测USP16可能在C731位点发生S-硝基化，该位点在人类、小鼠和大鼠中高度保守。缺氧导致USP16-WT转染的心肌细胞中SNO-USP16水平升高，而在C731突变体中被消除。缺氧刺激心肌细胞中降低的GSH/GSSG比值和细胞活力以及升高的ROS水平被C731位点突变逆转。USP16-WT转染在缺氧条件下下调了KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平，这在USP16-C731A转染的心肌细胞中被部分抵消。在体实验中，AAV9-USP16-C731A递送比AAV9-USP16-WT更能改善CME大鼠的心功能，减轻缺血、微栓塞和凋亡，更有效地逆转USP16、KDM1A、GCLM和GLS表达下调，提高GSH/GSSG比值，降低ROS水平。这些发现表明C731位点的SNO-USP16参与了CME诱导的GSH失衡。

C731位点的SNO-USP16促进KDM1A泛素化

鉴于SNO-USP16有助于CME中的GSH失衡，研究人员进一步阐明了SNO-USP16是否影响KDM1A蛋白泛素化。Co-IP显示，缺氧条件下USP16与KDM1A蛋白间的相互作用减弱，C731位点突变可恢复这种相互作用。USP16-C731A转染或MG132处理可上调缺氧暴露心肌细胞中的KDM1A蛋白水平，而USP16-C731A转染和MG132处理联合应用则进一步增强这种效应。CHX追踪实验表明，USP16-C731A转染延迟了缺氧刺激心肌细胞中KDM1A蛋白的降解。缺氧刺激升高的KDM1A泛素化水平在USP16-C731A转染的心肌细胞中被消除。因此，抑制C731位点的SNO-USP16可抑制KDM1A的泛素化和降解。

iNOS介导的SNO-USP16导致CME诱导的GSH失衡和KDM1A下调

缺氧刺激促进iNOS活化，进而促进NO产生。过量的NO产生可促进多种疾病发病机制中蛋白质的S-硝基化。研究人员进一步探讨了iNOS对CME背景下SNO-USP16的调控。使用iNOS抑制剂1400W处理，可有效逆转缺氧诱导的SNO-USP16上调。缺氧条件下减弱的USP16与KDM1A之间的相互作用被1400W恢复。缺氧诱导的GSH/GSSG比值降低、细胞活力下降以及ROS水平升高被1400W部分抵消。1400W处理部分逆转了缺氧刺激心肌细胞中USP16、KDM1A、GCLM和GLS蛋白水平的降低。在体评估iNOS抑制对CME的影响，发现1400W给药通过增强EF和FS水平，降低血清CK-MB、LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV水平，改善了CME大鼠的心功能。1400W治疗减少了CME大鼠心脏的缺血区域，抑制了凋亡和微栓塞。随后，CME大鼠心脏组织中iNOS表达升高以及USP16、KDM1A、GCLM和GLS表达降低被1400W处理消除。CME组中升高的SNO-USP16水平被1400W照射部分降低。此外，1400W处理提高了CME大鼠心脏的GSH/GSSG比值，降低了ROS水平。综上所述，iNOS通过促进USP16的S-硝基化，降低KDM1A表达，从而损害CME中的GSH稳态。

本研究结论表明，iNOS介导的USP16在C731位点的S-硝基化，通过促进E3泛素连接酶RNF138对KDM1A蛋白K355位点的泛素化修饰，导致KDM1A经泛素-蛋白酶体途径降解。KDM1A的下调使其无法通过去除GCLM和GLS启动子区域的H3K9me1/2修饰来促进这两个关键基因的转录表达，最终破坏GSH稳态，加剧CME诱导的心肌损伤。这一新机制的揭示，不仅深化了对CME病理过程的理解，更重要的是指出了USP16/KDM1A轴作为干预CME的潜在新靶点。抑制USP16的S-硝基化或增强KDM1A的稳定性，可能成为治疗CME诱导的心肌损伤的新策略。

研究的创新之处在于首次揭示了USP16 S-硝基化在CME中的关键作用，并阐明了从iNOS激活到GSH稳态破坏的完整信号通路：iNOS↑ → SNO-USP16↑ → USP16活性↓ → KDM1A泛素化降解↑ → GCLM/GLS转录↓ → GSH合成↓ → 氧化应激↑ → 心肌损伤。这一通路的解析为CME的防治提供了多个可能的干预环节，具有重要的理论意义和潜在的临床转化价值。

该研究也存在一些局限性，例如未在基因敲除动物或临床样本中验证数据；缺乏CME的体外模型，使用缺氧刺激的细胞模型可能无法完全模拟CME的所有方面；未能确定大鼠CME模型中微栓塞的确切位置等。这些局限性为未来研究提供了方向。

总之，这项研究系统地阐明了iNOS-USP16-KDM1A-GCLM/GLS轴在CME诱导心肌损伤中的重要作用，深化了对CME发病机制的理解，并为开发新的治疗策略提供了重要的理论依据和潜在靶点。研究成果发表在《Nature Communications》上，体现了其重要学术价值。