宏基因组测序在约四小时内实现复杂性尿路感染的精准病原体鉴定和抗菌药物敏感性分析

《Nature Communications》：Metagenomic sequencing enables accurate pathogen and antimicrobial susceptibility profiling in complicated UTIs in approximately four hours

本研究针对复杂性尿路感染(cUTI)诊断周期长(2-4天)的临床痛点，开发了基于皂苷和盐激活核酸酶(SAN)的宿主细胞去除技术，结合纳米孔测序，建立了仅需约4小时的快速诊断流程。该方法在78例临床样本中验证，病原鉴定准确率达99%，药敏预测准确率90%，成本仅36美元/样本，显著优于商业试剂盒，为UTI的精准诊疗和抗菌药物管理提供了创新方案。

　　

尿路感染(UTI)是全球第二大常见感染性疾病，每年影响约4.05亿人，在过去三十年间，因UTI导致的全球死亡人数惊人地增长了140%。尤其值得关注的是，未经治疗的UTI可能迅速发展为肾盂肾炎甚至尿脓毒症，后者约占所有脓毒症病例的四分之一。更棘手的是，导管相关性UTI占医院获得性感染的75-95%，若未及时处理，继发性血流感染可能将死亡率提升至30%的高风险水平。

面对这一严峻挑战，当前的临床诊断主要依赖传统尿液培养方法，但从样本采集到获得抗生素敏感性结果通常需要2-4天的时间窗口。对于重症UTI患者而言，及时使用有效抗生素至关重要，这种时间延迟无疑会严重影响治疗效果。此外，UTI的病因复杂多样，包括多种毒力因子和耐药菌株的参与，特别是多药耐药现象日益普遍。抗菌药物耐药性(AMR)通常涉及多基因特性，仅通过扩增单个耐药基因难以全面识别。随着综合征感染、多微生物感染和AMR的复杂性不断增加，对多重分子诊断技术的需求变得愈发迫切。

传统培养方法还存在其他局限性：对苛养菌、生长缓慢的病原体检测效果不佳，且无法直接检测AMR基因。宏基因组下一代测序(mNGS)技术则展现出独特优势，它能够无偏倚地检测临床样本中的完整微生物组(包括单微生物和多微生物UTI)以及已知的耐药机制(AMR基因、单核苷酸多态性、插入缺失等)。特别是基于纳米孔测序的mNGS技术，近年来在感染性疾病诊断领域显示出巨大潜力。

然而，将宏基因组学流程应用于临床样本仍面临重大挑战。患者尿液样本中病原体载量变化大，宿主细胞与细菌比例高，且含有晶体盐、尿素和β-hCG等成分，这些都使DNA提取过程复杂化。更具体地说，人类细胞基因组约有32亿个碱基，而平均细菌基因组仅有500万个碱基，这意味着典型人类细胞所含DNA量是平均细菌细胞的1000倍(6.4皮克对比5飞克)。这种数量级差异使得从患者尿液样本中提取细菌DNA变得异常复杂。

近期发表在《Nature Communications》的一项研究针对这些挑战开展了创新性探索。由挪威内陆大学、吉森大学等机构研究人员组成的团队开发了一种快速、经济高效的诊断方法，能够在约四小时内完成复杂性UTI的精准诊断。研究团队共评估了11种样本制备方法(8种内部开发方法和3种商业试剂盒)，涉及78例复杂性UTI患者的样本，通过实时纳米孔测序和数据分析，系统比较了各方法的性能。

关键技术方法包括：基于皂苷和盐激活核酸酶(SAN)的宿主细胞去除技术、磁珠法DNA提取(Naxtra Blood核酸提取试剂盒)、纳米孔快速条形码建库技术，以及基于BLASTn和abricate的生物信息学分析流程。临床样本来自德国吉森大学医院泌尿科的患者，包括中段尿和导管尿样本，所有样本均通过尿流式细胞术确认白细胞阳性。

宿主去除效率评估显示优化方法性能卓越

研究人员首先开发了八种内部方法，旨在选择性去除丰富的宿主细胞并富集细菌群体。这些方法与三种商业试剂盒相比，从加标尿液样本开始评估，逐步过渡到真实患者样本。qPCR实验显示，中等盐激活核酸酶(M_SAN)在宿主去除方面略优于热不稳定性盐激活核酸酶(HL_SAN)。优化后的方法(M+BB+NB)在加标的大肠杆菌样本中实现了约10³倍的宿主DNA去除，显著优于Host Zero试剂盒(约10²倍)和Molysis Complete 5试剂盒(约10倍)。在不同临床尿路致病序列类型的验证中，优化方法 consistently表现出平均10³倍的宿主去除效果，且不损失细菌DNA。

病原体鉴定准确率高达99%揭示方法优越性

在78例临床样本中，所有样本均为白细胞阳性，样本队列包含约38%女性和62%男性患者。复杂性UTI样本队列包括65例(83%)培养阳性样本和13例(17%)培养阴性对照。阳性样本微生物学特征复杂，41%(32/78)为多微生物感染，42%(33/78)为单微生物感染。约44%(14/32)的多微生物样本含有三种或更多病原体。

优化方法(M+BB+NB)在53例样本中展示了99%(100/101)的总体准确率，正确识别了88种病原体和13例阴性样本。仅出现一例假阴性(样本75中，在肺炎克雷伯菌混合感染中未检测到奇异变形杆菌)。非优化的内部方法平均准确率为77%(49/64)，商业方法为81%(26/32)。大肠杆菌和粪肠球菌是最常见的病原体，分别出现在33%(29/88)和19%(17/88)的样本中。优化方法还在9个测试样本中识别出常规检测最初遗漏的13种额外病原体，包括尿气球菌、沙氏放线菌等难以培养的病原体，这些结果后续通过Vivalytic或PCR得到了确认。

抗菌药物敏感性预测准确性达90%

在抗菌药物敏感性预测方面，优化方法达到了90%(589/653)的准确率，特异性为95%。非优化的内部方法和商业方法分别达到88%(200/226)和76%(170/225)的准确率。在88种细菌病原体中，51种有常规药敏数据可用，42种病原体对至少一种抗生素表现出耐药性。最常见的抗生素耐药是针对氨苄西林(22种病原体)。最普遍的共现耐药是氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸(14种病原体)。AcrAB-TolC是最常观察到的耐药机制，在7个分离株中被识别。

方法比较显示优化方案全面占优

在9个样本上的直接比较显示，优化方法实现了100%准确率(16/16)，而M+LZ+NB、H+BB+NB、H+LZ+NB和MC5方法的准确率分别为91%、57%、50%和77%。在药敏测试比较中，优化方法准确率最高(89%)，特异性达95.3%，且未过度预测耐药性。

检测阈值和成本效益分析支持临床转化

流式细胞术数据与测序读长的相关性分析表明，该方法在细菌与宿主细胞比率低至0.5时仍能准确识别病原体和预测药敏。AUROC分析显示，细菌细胞计数的AUROC为0.90，DNA产量的AUROC为0.87，表明这两种指标均可作为区分培养阳性和阴性样本的可靠预测指标。优化方法的每个样本成本约为36美元，比商业试剂盒低30%，且通过基于流式细胞术的预筛策略，成本可进一步降低至约6美元。

该研究开发的优化方法将UTI诊断时间从传统方法的2-4天大幅缩短至约4小时，实现了从样本接收到临床决策的快速转化。这一突破性进展主要体现在四个方面：首先，方法准确率高，病原鉴定和药敏预测分别达到99%和90%的准确率；其次，检测灵敏度高，可识别常规诊断遗漏的病原体；第三，成本效益显著，优于现有商业方案；最后，通过预筛策略可进一步优化资源配置。

这种精准、快速且经济高效的诊断方法有望显著改善复杂性UTI的临床管理，特别是在时间敏感状况如尿脓毒症和肾移植感染中发挥关键作用。通过将诊断时间从数天缩短至数小时，该方法可显著减少经验性广谱抗生素的使用，据估算每年可能避免16.2亿日剂量的不必要抗生素暴露。这不仅将优化UTI治疗策略，还将强化抗菌药物管理和诊断指导，从而遏制抗菌药物耐药性的进一步发展。

研究的局限性主要在于当前方法尚不能检测真菌病原体，因为皂苷的裂解作用通过与真核细胞膜中的固醇基团相互作用介导，而真菌细胞膜含有麦角固醇，使其对皂苷和后续的渗透压敏感。未来修订协议时应促进真菌病原体的检测。此外，优化方法仅在有限数量的临床分离株上进行了测试，需要在更大队列中进一步验证。

总体而言，这项研究为UTI的快速精准诊断提供了创新解决方案，将宏基因组测序技术与优化的样本前处理流程相结合，实现了在临床可行的时间框架内提供全面病原信息和药敏谱的目标，为感染性疾病的诊断管理树立了新标杆。