耐药肺炎克雷伯菌在污水处理厂进出水中的基因组特征与抗生素耐药性传播风险分析

《Scientific Reports》：Comprehensive genome analysis of MDR Klebsiella pneumoniae in influent and effluent of a selected wastewater treatment plant

语 本研究针对污水处理厂(WWTP)在抗生素耐药性传播中的关键角色，选取耐多药肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)为研究对象，通过培养组学与全基因组测序(WGS)相结合的方法，解析其抗生素耐药基因(ARGs)和毒力因子分布。研究发现，尽管污水处理过程降低了部分耐药基因，但出水中仍残留包括超广谱β-内酰胺酶基因(blaSHV、blaOXA等)在内的多种耐药决定簇，且毒力基因数量在出水中显著增加。质粒（如IncFIB(K)）和噬菌体的检测进一步提示水平基因转移(HGT)风险。该研究强调了WWTP作为ARGs扩散热点的潜在威胁，为完善废水耐药性监控策略提供了重要基因组学依据。

　　

随着全球抗生素耐药性(AMR)问题的日益严峻，环境介质作为耐药基因传播的“中转站”受到广泛关注。污水处理厂(WWTP)尤其被视为抗生素耐药菌(ARB)和耐药基因(ARGs)传播的关键环节，其处理过程中微生物群落密集、营养物质丰富，加之抗生素的选择压力，极易促进耐药基因的水平转移。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)作为ESKAPE病原体之一，不仅在医院内引发高死亡率感染，更在环境中表现出强大的适应性，能够通过质粒、整合子等可移动遗传元件捕获和传播耐药基因。然而，传统基于培养和16S rRNA测序的方法难以全面揭示耐药基因的多样性和传播潜力，尤其在废水处理这一动态复杂的生态系统中，亟需借助全基因组测序(WGS)等高分辨率技术厘清耐药菌的种群结构、基因特征及生态行为。

为此，研究人员选取南非西北省一家市政污水处理厂，分别从进水口和出水口（氯化处理后）分离肺炎克雷伯菌菌株，结合表型检测和WGS技术，系统比较了菌株的耐药谱、毒力基因携带情况、质粒/噬菌体分布及基因组进化特征。该研究发表于《Scientific Reports》，旨在揭示处理过程中耐药菌的存活与演化规律，为阻断环境耐药性传播提供科学依据。

本研究主要采用以下关键技术：采集污水处理厂进出水样本，通过选择性培养基分离肺炎克雷伯菌；利用16S rRNA测序进行物种鉴定；通过药敏试验分析菌株的表型耐药性；借助全基因组测序（纳米孔测序技术）完成菌株基因组从头组装、注释及比较基因组分析；使用CARD、ResFinder等数据库注释ARGs，利用PlasmidFinder、VFDB等工具预测质粒复制子类型和毒力因子；基于全基因组和蛋白质组序列构建系统发育树，分析菌株亲缘关系。

物理化学参数

进出水样本的pH值均符合目标水质范围（TWQR），但出水中总溶解固体（TDS）、磷酸盐和硝酸盐浓度超标，高化学需氧量（COD）表明有机污染物负荷较大，为耐药菌存活提供了条件。

表型致病性、抗生素敏感性及ARGs

所有5株肺炎克雷伯菌（进水2株NW-I1、NW-I2，出水3株NW-E1、NW-E2、NW-E3）均对氨苄西林(AMP)和头孢唑林(KZ)耐药，且携带β-内酰胺酶基因（如bla_VIM、bla_SHV、bla_OXA）。值得注意的是，出水菌株NW-E2同时检出3种β-内酰胺酶基因，提示处理过程中耐药基因富集。

基因组特征

基因组圈图显示各菌株编码序列、GC含量等特征明确；Bandage组装图显示进水菌株携带更多质粒（如NW-I1有7个），而出水菌株质粒数量减少但ARGs多样性增加，表明质粒可能参与基因重组或丢失。

基于基因组的系统发育分析

全基因组和蛋白质组序列构建的系统发育树均确认5株菌为肺炎克雷伯菌，且进化关系相近，暗示它们可能来源于同一克隆系或具有高度基因组可塑性。

基因组检测的ARGs

共鉴定到51种ARGs，其中出水菌株携带数量（31个）高于进水（20个）。β-内酰胺类耐药基因占比最高（进水70%，出水45%），fosA6、tet(D)、sul1、sul2为共有基因。出水特有基因（如bla_SHV-1、cmlA1）增多，提示处理过程中发生基因水平转移或菌株适应性进化。

毒力基因分布

105个毒力基因中，43个为核心毒力基因（如黏附相关fim系列、铁载体ent系列）。出水菌株独有的毒力基因（如编码耶尔森菌素ybt系列）更多，涉及黏附、生物膜形成和铁摄取，可能增强其在低营养环境中的生存能力。

质粒与噬菌体

IncFIB(K)和IncFII(K)是主要质粒类型，常携带ESBLs基因。进水菌株携带更多噬菌体（14个），而出水菌株噬菌体数量减少但ARGs多样性增加，暗示噬菌体可能参与基因转移事件。

讨论与结论

本研究通过整合表型与基因组学数据，证实污水处理厂出水中耐药肺炎克雷伯菌仍保留丰富的ARGs和毒力基因，且部分基因（如bla_SHV）与临床菌株高度同源，提示环境菌株可能向临床传播风险。比较基因组分析显示，出水菌株具有更高的基因组可塑性（更多独有基因簇），表明废水环境施加了强烈的选择性压力，促进菌株适应性进化。尽管氯化处理可减少细菌总量，但可能筛选出更具耐受性的亚群。

该研究的意义在于首次从基因组层面揭示南非污水处理厂中肺炎克雷伯菌的耐药动态，强调当前处理工艺对耐药基因的去除效果有限，亟需加强出水监测与深度处理技术研发。未来需结合转录组学、接合实验等手段，验证ARGs的表达与转移活性，为制定针对性的环境AMR管控策略提供理论支撑。