Meis因子在晚期视网膜祖细胞中的过表达对时序模式化和神经发生的复杂调控作用

《Scientific Reports》：Overexpression of Meis factors in late-stage retinal progenitors yields complex effects on temporal patterning and neurogenesis

本研究针对晚期视网膜祖细胞（RPCs）时序身份重编程的难题，探讨了过表达早期发育相关转录因子MEIS1和MEIS2能否诱导其向早期出生细胞类型转化。通过电穿孔和单细胞RNA测序技术，研究发现MEIS1和MEIS2虽能部分上调早期基因调控网络组分，但不足以抑制晚期转录因子或改变细胞命运命运定向；MEIS1抑制增殖而MEIS2加速神经发生进程。该成果为再生医学中细胞重编程策略提供了重要理论依据。

　　

脊椎动物的视网膜作为中枢神经系统的侧向延伸，长期以来被视为研究神经发生和细胞命运决定的经典模型。视网膜中的六种主要神经元和一种胶质细胞均来源于视网膜祖细胞（Retinal Progenitor Cells, RPCs），这些细胞按照高度保守的时序顺序依次产生：视网膜神经节细胞最先出现，随后是水平细胞、GABA能无长突细胞、视锥细胞、非GABA能无长突细胞、视杆细胞、双极细胞，最后是穆勒胶质细胞。这种时序模式化的核心在于RPCs内在的基因调控网络（Gene Regulatory Network, GRN）的动态变化，其中早期和晚期阶段的转录因子（Transcription Factors, TFs）相互拮抗，共同决定不同时间点RPCs的发育潜能（即“时序身份”）。

尽管研究已经鉴定出如Ikaros家族锌指蛋白1/4（Ikzf1/4）、核因子I A/B/X（Nfia/b/x）、叉头框蛋白P1（Foxp1）和CasZ锌指蛋白1（Casz1）等关键因子参与调控时序身份，但整个网络的运作机制仍有许多未知。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-Seq）技术揭示了更多潜在调控因子。Meis同源框1和2（Meis1和Meis2）被预测是早期阶段GRN的重要成员，它们在早期RPCs中高表达，并可能正调控多个早期阶段TFs。基因功能研究表明，Meis因子对于视网膜的早期模式形成和神经发生启动至关重要。例如，斑马鱼中meis1的缺失会影响视网膜背腹轴和鼻颞轴的 patterning，而小鼠中Meis1的缺失则会延迟神经发生 onset。然而，Meis因子在视网膜神经发生晚期阶段（如出生后）的作用，特别是能否通过异位表达来“逆转”晚期RPCs的时序身份，诱导其产生早期出生的细胞类型（如视锥细胞、视网膜神经节细胞），仍是悬而未决的问题。这个问题的答案对于开发基于细胞重编程的视网膜退行性疾病（如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性）再生治疗策略具有关键意义，因为目前旨在将穆勒胶质细胞重编程为神经元的尝试大多未能有效产生光感受器。

为了回答这一问题，来自约翰斯·霍普金斯大学医学院的Patrick Leavey、Lizhi Jiang、Nicole Pannullo、Clayton Santiago和Seth Blackshaw研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究。他们假设在晚期RPCs中过表达MEIS1和MEIS2可能能够重塑其时序身份，诱导早期出生细胞类型的生成。

研究人员主要运用了小鼠视网膜外植体离体培养、电穿孔基因过表达、5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷（EdU）掺入增殖检测、荧光激活细胞分选（FACS）以及单细胞RNA测序（scRNA-Seq）等技术方法。研究样本为胚胎第19天（E19）至出生后第0天（P0）的小鼠视网膜。

Meis1和Meis2在视网膜祖细胞中的表达

通过对已发表的小鼠和人类视网膜scRNA-Seq数据的分析，研究人员确认Meis1和Meis2在小鼠早期（约E12）的原代RPCs和神经源性RPCs中高表达，随后表达下降。在人类视网膜中，MEIS1的表达从妊娠第8周（GW8）开始逐渐下降，而MEIS2则呈现出不同的模式，在GW17达到峰值。对预测的Meis1/2靶基因的分析显示，在小鼠中，被预测为Meis1/2激活的基因在早期RPCs中富集，而被预测为抑制的基因则在晚期上调。在人类中，被预测抑制的基因同样在晚期上调，但被预测激活的基因在早期RPCs中的富集程度较弱。

MEIS1和MEIS2在晚期小鼠视网膜祖细胞中的过表达

为了探究功能，研究团队将表达人类MEIS1、MEIS2或两者混合（MEIS1+MEIS2）的pCAGIG质粒通过电穿孔导入P0小鼠视网膜外植体，以空载体（GFP）作为对照。外植体培养至P2或P5后，通过FACS分选GFP阳性细胞进行scRNA-Seq分析。UMAP聚类和标记基因表达分析确定了各种细胞类型，包括原代RPCs、神经源性RPCs、无长突细胞、视杆细胞、双极细胞等。细胞类型比例分析显示，过表达MEIS1或MEIS2并未改变P2或P5时任何细胞类型的比例，表明单独过表达这些因子不能诱导晚期RPCs产生早期出生的细胞类型（如视网膜神经节细胞、视锥细胞等），也不影响神经发生的整体进程或RPCs的维持。

MEIS1和MEIS2调控早期阶段视网膜祖细胞特异性基因的表达

尽管细胞命运未变，基因表达却发生了显著变化。MEIS1过表达能激活内源性Meis1的表达，但不影响Meis2；反之，MEIS2过表达激活内源性Meis2，不影响Meis1。两者均能显著上调早期RPC标志物高迁移率族蛋白A1（Hmga1）。然而，它们调控的基因集合存在巨大差异：MEIS1特异性上调Notch通路效应分子Hes1和Hes5，并下调神经源性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）因子Neurod1和Neurod4；而MEIS2则特异性上调早期因子前B细胞白血病转录因子1（Pbx1）、E2F转录因子1（E2f1）、Foxp4以及晚期因子Nfib，并下调Neurod4。两者共表达反而逆转了部分效应，如增加了Neurod1和Neurod4的表达。基因本体（GO）分析显示，MEIS1和MEIS2调控的基因均富集在神经发生、胶质发生、凋亡和糖酵解等过程，但具体基因重叠很少。此外，MEIS2（单独或与MEIS1联合）能在原代和神经源性RPCs中激活视锥细胞特异性基因，并在P5时激活无长突细胞特异性基因。

MEIS1和MEIS2过表达对视网膜祖细胞时序身份和分化的影响

研究人员通过计算早期和晚期标志物的富集得分（使用AUCell包）来评估时序身份。结果显示，MEIS1在P2和P5的原代及神经源性RPCs中均强烈诱导早期标志物表达。MEIS2仅在P5的原代RPCs中表现出此效应。两者共表达增强了早期身份。出乎意料的是，没有任何处理能抑制晚期标志物；相反，MEIS1和MEIS1+MEIS2甚至上调了这些基因。在原发性RPCs中，MEIS2在P2时抑制了穆勒胶质细胞特异性基因，同时诱导了无长突细胞/水平细胞和视锥细胞的标志物。在神经源性RPCs中，MEIS2在P2和P5均上调了无长突细胞/水平细胞、视锥细胞以及双极细胞的特异性基因。

在增殖方面，细胞周期分析显示，在P2时，MEIS1增加了原代RPCs中G2期细胞的比例，并上调了增殖细胞核抗原（Pcna）和标记指数Ki-67（Mki67）的表达，但在P5时减少了G2期细胞。MEIS2对原代RPCs的细胞周期影响不大。在神经源性RPCs中，所有MEIS过表达条件在P2时都增加了S/G2期转换细胞的比例，MEIS2在P5时仍维持此效应。然而，直接的EdU掺入实验（在P3, P5, P7脉冲标记，P8检测）表明，MEIS1过表达显著降低了GFP阳性细胞中EdU阳性的比例，而MEIS2无影响。进一步分析发现，MEIS1过表达增加了原代和神经源性RPCs中促凋亡基因的总体得分，这可能是导致观察到的EdU阳性细胞减少的原因。伪时间分析（使用Monocle3）表明，MEIS2在P2时加速了最年轻的原代RPCs的分化，MEIS1和MEIS2在P5时均有此效应。在神经源性RPCs中，MEIS2在P2和P5均加速了分化，而MEIS1无影响。处理对最老的祖细胞群体没有影响。

研究结论与意义

本研究系统地评估了在晚期视网膜祖细胞中异位表达MEIS1和MEIS2的影响。尽管Meis因子在早期视网膜发育中不可或缺，但它们在晚期RPCs中的过表达并不能完全重编程其时序身份或改变细胞命运定向。然而，它们确实能够调控与早期阶段相关的基因表达程序，并影响RPCs的增殖和分化动力学。MEIS1和MEIS2虽然功能上有部分重叠（如均上调Hmga1，并影响神经发生、凋亡和代谢相关基因），但它们调控的基因集合存在显著差异，提示它们可能通过不同的分子途径发挥作用。MEIS1表现出抑制增殖和神经发生的倾向，而MEIS2则倾向于促进神经发生进程和特定神经元（如视锥细胞、无长突细胞）相关基因的表达。

该研究揭示了使用单一或少数几个转录因子进行细胞命运重编程的复杂性。未能实现完全重编程的可能原因包括：1）Meis因子功能的发挥依赖于早期阶段GRN中其他共存因子或辅因子的协同作用，这些在晚期RPCs中可能缺失；2）离体实验环境缺乏在体情况下可能存在的关键外在信号；3）过表达可能诱导凋亡，导致成功重编程的细胞选择性丢失。

这些发现对再生医学具有重要意义。它提示，要想成功地将多能干细胞或内源性视网膜胶质细胞（如穆勒胶质细胞）重编程为特定类型的神经元（尤其是光感受器）以治疗致盲性眼病，可能需要更全面地理解并操控整个调控时序模式的基因网络，而非仅仅依赖个别因子。未来的研究需要致力于揭示这些复杂网络的完整图谱和相互作用机制，从而为开发更有效的视网膜再生策略奠定基础。