L-A9肽的氧化还原特性及其与双链DNA相互作用的电化学与光谱学研究

《Scientific Reports》：Redox investigation of L-A9 peptide and evaluation of its binding with double stranded DNA

本研究针对短肽与DNA相互作用机制不明确的问题，通过电化学和光谱学方法系统研究了HER2靶向肽L-A9的氧化还原特性及其与dsDNA的相互作用。研究人员开发了基于金纳米粒子修饰电极的高灵敏度检测方法（检测限达1.17×10-7 M），发现L-A9与dsDNA的结合常数为1.8×105 M-1，并通过分子对接证实了其通过酸性基团与DNA大沟、碱性基团与磷酸二酯基团的结合模式。该研究为肽类药物的设计开发和生物传感应用提供了重要理论依据。

　　

在精准医疗快速发展的今天，短肽类药物因其分子量小、穿透性强、免疫原性低等优势，在肿瘤靶向治疗领域展现出巨大潜力。其中，L-A9肽作为一种由赫赛汀抗体片段衍生的九氨基酸短肽，能够特异性结合人类表皮生长因子受体2（HER2），在乳腺癌、卵巢癌等多种过度表达HER2的癌症治疗中具有重要应用前景。然而，肽类药物在实际应用中仍面临诸多挑战，包括其与生物大分子如DNA的相互作用机制不明确，这直接影响了其在基因表达调控和药物递送系统中的效率与安全性。

以往的研究主要集中在肽类药物的合成和靶向性方面，而对于其氧化还原特性及与DNA相互作用机制的系统研究相对缺乏。特别是像L-A9这样的具有生物医学应用价值的短肽，其电化学行为如何，如何与双链DNA（dsDNA）结合，结合强度如何，这些科学问题都有待深入探索。理解这些基本科学问题，不仅有助于优化肽类药物的设计，还能为开发新型生物传感器和基因调控策略提供理论指导。

为了解决这些问题，来自巴巴原子研究中心的Satpati教授团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，系统探讨了L-A9肽的氧化还原特性，并首次通过多种技术手段评估了其与dsDNA的相互作用机制。

研究人员主要采用了差分脉冲伏安法（DPV）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、电化学阻抗谱（EIS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）以及分子对接等技术方法。研究中使用的双链DNA来自小牛胸腺，L-A9肽通过固相合成法制备，并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。

电化学和UV-Vis光谱研究A9肽

研究发现L-A9肽的氧化峰电位强烈依赖于溶液pH值，随着pH值升高，氧化峰电位向负方向移动，斜率约为25 mV/pH，表明氧化过程涉及2个电子和1个质子转移。研究人员开发了基于金纳米粒子（AuNPs）修饰玻碳电极的电化学检测方法，在pH 7条件下获得最佳检测灵敏度，检测限达1.17×10^-7 M。紫外-可见光谱研究显示，肽在约200 nm处有特征吸收峰，对应于肽键的n→π*跃迁，在pH 7时同样表现出最佳检测性能。

电化学阻抗谱（EIS）探索

EIS分析揭示了L-A9肽在不同电位下的界面行为。在低于氧化峰电位（0.15 V）时，阻抗谱需要用复杂的等效电路拟合，表明存在多种界面过程。而在氧化峰电位（0.2 V）和更高电位（0.25 V）时，阻抗响应简化，表明形成了更均匀的电荷转移过程。

肽-DNA结合的可视化研究

通过DPV和UV-Vis光谱研究了L-A9肽与dsDNA的相互作用。随着dsDNA浓度增加，氧化峰电流和电位发生系统性变化，表明肽-DNA复合物的逐渐形成。在pH 7条件下结合最强，结合常数分别为1.85×10⁵ M^-1（电化学法）和4.1×10⁴ M^-1（光谱法）。结合过程伴随着明显的电位正移，表明复合物形成降低了肽的氧化能力。

FTIR和拉曼光谱阐明L-A9肽-dsDNA相互作用

FTIR和拉曼光谱分析为肽-DNA相互作用提供了分子水平证据。FTIR光谱中，复合物在1070 cm^-1处出现新峰，对应于磷酸基团的对称伸缩振动，而3300-3400 cm^-1区域的加宽和位移表明新氢键的形成。拉曼光谱中，磷酸伸缩峰从1080 cm^-1（游离DNA）位移至1073 cm^-1（复合物），表明肽与DNA磷酸骨架存在直接相互作用。

表面电荷景观的Zeta电位分析

Zeta电位分析显示L-A9肽的表面电荷具有明显的pH依赖性。在酸性条件下肽带正电，中性条件接近等电点，碱性条件带负电。在pH 7时，dsDNA的zeta电位为-19 mV，L-A9肽为1.5 mV，而两者复合物的zeta电位降至-1 mV，表明发生了显著的电荷中和效应，支持了静电相互作用在结合过程中的重要作用。

AFM和SEM形貌测量

AFM和SEM观察直观展示了肽-DNA相互作用的形态学变化。L-A9肽单独存在时形成针状组装体，dsDNA呈现线团状形态，而两者相互作用后形成更粗糙、不均匀的表面结构，dsDNA线状结构明显增粗，表明发生了显著的形态重组。

分子对接研究

分子对接结果显示，L-A9肽以延伸构象结合在DNA的大沟区，结合自由能约为-32.2 kJ/mol。肽的酸性功能基团与DNA大沟相互作用，修饰了链间的三个氢键，而碱性功能基团则与磷酸二酯基团的氧原子形成键合，这一发现与实验结果表明的两种结合模式一致。

本研究通过多技术联用的策略，全面揭示了L-A9肽的氧化还原特性及其与dsDNA的相互作用机制。研究发现L-A9肽的氧化涉及2电子1质子转移过程，并成功建立了高灵敏度的检测方法。最重要的是，研究首次证实L-A9肽通过酸性基团与DNA大沟、碱性基团与磷酸骨架的协同作用与dsDNA结合，结合常数达10⁴-10⁵ M^-1量级，且在生理pH条件下结合最强。

这些发现不仅深化了对短肽与DNA相互作用机制的理解，还为合理设计基于肽的靶向药物和生物传感器提供了重要理论依据。特别是L-A9肽作为HER2靶向肽，其与DNA相互作用特性的阐明，对于开发联合基因治疗和靶向治疗的新型抗癌策略具有重要指导意义。该研究建立的多方法综合评价体系也可为其他生物活性肽的研究提供参考模板。