综述：可编程的大容量载体整合技术：突破尺寸限制，助力下一代基因治疗的发展

大DNA插入技术：CRISPR相关转座酶（CASTs）、Prime编辑器整合酶及nCas9-R2系统在基因组编辑中的应用与挑战 CRISPR衍生工具如Base/Prime编辑器和新型大片段插入系统（如 CASTs、PE-integrase、nCas9-R2）通过避免双链断裂（DSB）提升编辑精度，但存在效率低、递送困难等问题。CASTs利用Tn7转座酶机制实现RNA引导的大DNA插入（>1kb），其Type I-F和V-K亚型在细菌和哺乳动物细胞中表现突出，但需优化递送和特异性。Prime编辑器通过整合酶（如Bxb1）和双sgRNA策略增强插入能力，在植物和哺乳动物中效率达10%-35%，但仍受限于递送容量。nCas9-R2系统通过 nickase 靶向和R2 retrotransposon机制实现 scarless 插入，但哺乳动物细胞效率不足1%。挑战包括递送载体限制（如AAV容量不足）、非特异性插入及免疫原性，未来需结合定向进化、新型递送系统和机制解析提升临床应用潜力。

　　
近年来，基因编辑技术取得了革命性进展，尤其是基于CRISPR-Cas系统的衍生工具在精准基因修饰中展现出独特优势。传统CRISPR-Cas系统依赖双链断裂（DSBs）机制，虽然实现了广泛的应用，但DSBs引发的非特异性修复和潜在基因组不稳定问题制约了其临床转化。为此，科研人员开发了多种无需DSBs的第三代基因编辑工具，其中大型DNA片段插入技术尤为关键。本文系统梳理了三类代表性技术——Tn7-like转座酶复合体（CASTs）、Prime Editing（PE）整合酶系统以及Cas9 nickase-R2融合蛋白（nCas9-R2），并深入探讨了其技术原理、应用场景及未来挑战。

### 一、技术革新背景
传统基因编辑工具（如锌指核酸酶、TALENs）因设计复杂、效率低下等问题逐渐被CRISPR-Cas系统取代。尽管CRISPR-Cas9和Cas12a等工具在单碱基编辑和基础替换方面表现优异，但大型DNA片段（>1kb）的插入效率仍受限于其依赖DSBs的机制。例如，在囊性纤维化（CF）治疗中，CFTR基因存在超过2000种致病突变，但现有BE/PE技术仅能靶向部分SNV和小片段插入。针对此类复杂突变体的临床需求，科学家们通过改造天然遗传元件，发展出三种新型插入技术。

### 二、核心技术解析
#### （一）Tn7-like转座酶复合体（CASTs）
1. **技术原理**
CASTs源自细菌Tn7转座子系统，通过融合CRISPR-Cas组件与转座酶基因（如TnsA、TnsB、TnsC），形成具有RNA指导功能的复合体。其核心机制包括：
- **RNA引导靶向**：通过crRNA识别靶位点，结合转座酶组件形成整合复合物。
- **无方向性插入**：在原核和真核细胞中均实现DNA片段的定向插入，部分系统（如ShHELIX）通过融合核酸内切酶nAnil，将插入方向误差率降至0.5%以下。
- **大片段承载能力**：成功整合10kb以上片段，且通过多组分优化（如添加ClpX因子）可显著提升真核细胞效率。

2. **技术分支与优化**
- **Type I–F型**：以VchCAST为代表，在原核系统中插入效率达13.4%，但真核细胞效率不足1%。通过工程化改造（如eCAST-3系统整合ClpX和NLS信号肽），在人类细胞中实现0.4%-1%的插入效率，但仍存在细胞毒性问题。
- **Type V–K型**：以ShCAST为例，在原核系统中插入2.2-10kb片段效率达25%-80%，但真核细胞应用受限。通过融合nAnil nickase（如ShHELIX）和改造RNP复合物结构，在哺乳动物细胞中实现5%-10%的插入效率，且特异性提升至96.5%。
- **新型亚型开发**：2023年通过系统发育分析和定向进化发现的I–C和IV型CAST，在跨物种应用中展现出潜力，但工程化难度较高。

#### （二）Prime Editing整合酶系统
1. **技术突破点**
PE系统通过融合逆转录酶（RT）与CRISPR核酸酶，实现无需DSBs的精准插入。其关键创新包括：
- **双sgRNA策略**：通过两个互补sgRNA引导的RT合成互补链，解决单链编辑导致的修复错误问题。TwinPE系统在人类细胞中插入5.6kb片段效率达17%，较传统PE3提升10倍。
- **催化酶优化**：采用Bxb1整合酶的定向进化版本（如eeBxb1），在10.5kb片段插入效率达35%，且对宿主细胞毒性显著降低。
- **植物适配系统**：PrimeRoot平台通过融合FLP重组酶和双sgRNA，在水稻细胞中实现11.1kb片段6.3%的插入效率。

2. **工程化改进方向**
后续研究通过引入CRISPR效应蛋白（如SpCas9 nickase）与PE复合，开发出PE-integrase系统。该系统结合PE的编辑能力和Bxb1的重组活性，在人类细胞中完成36kb片段的10%插入效率，但存在attP/attB位点残留问题。

#### （三）nCas9-R2融合系统
1. **创新机制**
该技术融合Cas9 nickase的靶向能力与R2逆转录转座子的整合功能，实现 truly scarless（无痕）插入：
- **靶向特异性**：通过sgRNA引导Cas9 nickase与R2 RNA模板结合，在核仁28S rDNA位点实现高达95%的插入效率。
- **无痕修复**：利用R2 UTR的内部比对序列（HA）作为锚点，避免留下终止密码子或转座酶残留序列。
- **大片段兼容性**：在人类HEK293T细胞中，成功整合12.7kb片段，效率达10%。

2. **临床转化挑战**
尽管STITCHR系统在AAVS1等位点表现出5%-11%的效率，但其依赖外源R2元件（如UTR和逆转录酶）的架构导致载体容量受限（>4.7kb）。研究显示，载体拆分递送可提升效率，但需解决多组分递送中的协同性难题。

### 三、技术对比与临床转化瓶颈
1. **性能矩阵**
| 技术 | 原核效率（%） | 真核效率（人类细胞） | 片段上限 | 特异性 |
|---------------|--------------|---------------------|---------|--------|
| Type I–F CAST | 13.4 | 0.4-1% | 14.78kb | 96.5% |
| V–K CAST | 25-80 | 0.06-1% | 10kb | 99% |
| PE-integrase | 0.5-17% | 3.2-35% | 36kb | 88.4% |
| nCas9-R2 | - | 5-10% | 12.7kb | 99% |

2. **共性挑战**
- **递送瓶颈**：所有系统均面临载体容量限制（AAV最大承载4.7kb），需开发新型递送载体（如合成病毒颗粒或脂质纳米颗粒）。
- **细胞毒性**：转座酶复合物（如TnsC）和整合酶（Bxb1）的过度表达易引发细胞凋亡，需优化蛋白表达水平与时空特异性。
- **免疫原性**：外源蛋白（如nCas9、TnsB）可能激活免疫反应，需通过人源化改造（如将Tn7蛋白替换为哺乳动物同源蛋白）降低风险。

3. **差异化局限**
- **CASTs**：依赖Tn7转座酶组件，哺乳动物细胞中需额外补充ClpX等因子。
- **PE系统**：插入方向受sgRNA设计限制，大片段效率衰减显著。
- **nCas9-R2**：对HA序列长度和位置高度敏感，需精确设计UTR区域。

### 四、未来发展方向
1. **系统整合与模块化**
开发多技术联用平台，例如将PE整合酶与nCas9-R2结合，利用PE的编辑能力预处理靶位点，再通过R2系统完成大片段插入，可显著提升复杂基因座的编辑效率。

2. **靶向位点扩展**
现有技术多聚焦于28S rDNA或安全 harbor位点（如CCR5、ACTB），需通过结构生物学解析R2蛋白的DNA结合特异性，开发通用靶向模块。

3. **递送系统革新**
- **病毒载体优化**：利用腺相关病毒（AAV）的假毛细管化（Pseudotyped）技术提升多组分递送效率。
- **非病毒递送**：工程化脂质纳米颗粒（LNPs）通过表面修饰实现蛋白复合物的稳定递送，如将Cas9-nickase与R2蛋白共封装于单颗粒载体。

4. **基础机制研究**
- **RNP复合物结构解析**：通过冷冻电镜和X射线晶体学揭示Cas9 nickase与R2 RNA模板的相互作用界面。
- **哺乳动物细胞转座机制**：研究R2蛋白在真核细胞中的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）及其对整合效率的影响。

### 五、临床应用前景
1. **单基因遗传病治疗**
针对囊性纤维化（CFTR基因突变）、杜氏肌营养不良（DMD相关大片段缺失）等疾病，可通过PE-integrase系统在安全 harbor位点（如AAVS1）插入全长正常基因或补偿性调控序列。

2. **肿瘤免疫治疗**
利用nCas9-R2系统在人间充质干细胞（MSCs）中精准整合CAR-T细胞受体基因（如CD19-CAR）和免疫检查点抑制剂，构建新型基因编辑免疫细胞。

3. **合成生物学应用**
在微生物中构建多基因簇插入系统，例如将工程菌的毒力基因（如白喉毒素）插入质粒，通过转座酶实现可控释放。

### 六、伦理与安全考量
1. **插入位点可控性**
需严格验证插入位点的稳定性，避免转座酶激活引发基因组不稳定。例如，R2系统在28S rDNA位点的插入可能影响核糖体功能，需通过亚细胞定位研究规避风险。

2. **基因驱动监控**
对于可能扩散的转座元件（如改造型Tn7），需建立实时监控系统，检测其在非靶位点的激活情况。

3. **伦理审查框架**
建议制定分级审查标准：
- 一类应用（<5kb片段）：仅需临床前毒理测试
- 二类应用（5-20kb片段）：需额外评估插入位点对关键基因的干扰
- 三类应用（>20kb片段）：禁止用于人类生殖细胞编辑

### 七、总结
三类技术虽在原理上路径各异，但均通过重构自然转座系统或整合酶的催化特性，突破了传统CRISPR系统的插入能力瓶颈。其中，nCas9-R2系统因实现真正无痕插入而备受关注，但其效率仍需提升至临床可接受水平（>30%）。未来研究需聚焦于：① 开发通用型递送系统解决载体容量限制；② 通过定向进化改造核心蛋白（如TnsB、Bxb1）提升哺乳动物细胞兼容性；③ 建立多技术联用平台处理复杂基因编辑需求。随着2025年新型合成转座酶（如I–D型CAST的TnsD蛋白人源化改造）的涌现，大片段精准插入技术有望在五年内实现首例临床转化。