多模态无标记成像揭示三维脑组织模型中神经元-胶质细胞代谢相互作用与氧化应激动态

《Communications Biology》：Multi-modal label-free imaging of cellular metabolism and oxidative stress in 3D brain tissue models

本研究针对脑细胞代谢异质性和相互作用难以实时监测的问题，开发了基于双光子荧光成像(TPEF)和荧光寿命成像(FLIM)的多模态无标记光学成像策略。研究人员通过光谱分解技术准确识别了NAD(P)H、黄素蛋白和脂褐素等内源性荧光团，建立了消除脂褐素干扰的定量方法，在三维工程化脑组织模型中实现了长达11周的代谢动态监测。结果表明神经元依赖氧化磷酸化(OXPHOS)而胶质细胞代谢更具可塑性，星形胶质细胞通过提供乳酸和谷氨酰胺等底物支持神经元功能并缓解氧化应激。该研究为研究脑疾病中的代谢功能障碍提供了重要技术平台。

　　

大脑作为人体最复杂的器官，其正常功能依赖于神经元与胶质细胞之间精细的代谢协作。神经元主要通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生ATP，而星形胶质细胞和小胶质细胞则能灵活利用OXPHOS、糖酵解或脂肪酸代谢。尤其重要的是，星形胶质细胞不仅满足自身代谢需求，还通过提供乳酸、谷胱甘肽(GSH)前体等方式支持神经元功能，并在谷氨酸-谷氨酰胺循环中发挥关键作用。然而，神经元由于谷胱甘肽再生能力有限和NADPH池较低，更容易受到氧化应激的损害。

理解脑细胞代谢异质性、动力学和相互作用需要非破坏性的单细胞分辨率方法。虽然正电子发射断层扫描(PET)、功能磁共振成像(fMRI)等技术能提供脑活动信息，但空间分辨率不足限制了单细胞代谢分析。转录组学和代谢组学虽然能解析细胞信号，但无法在活细胞中实时追踪代谢变化。高分辨率双光子成像克服了这些限制，但大多数研究依赖外源性荧光标记物，这些标记物在人类原代细胞中效率有限且只能捕获部分代谢组信息。

无标记双光子激发荧光(TPEF)成像通过检测内源性发色团的自发荧光，为实时分析脑切片和活体代谢提供了强大替代方案。该方法不依赖外源探针，能够在无需细胞操作的情况下研究神经元和胶质代谢。特别是NAD(P)H和黄素蛋白等内源性荧光团，它们作为氧化还原途径的关键参与者，其荧光特性可反映细胞代谢状态。然而，特异性常常受到重叠内源性信号的损害，其中脂褐素——一种由蛋白质、脂质和糖类组成的氧化大分子聚集体——由于与NAD(P)H和黄素的光谱重叠而干扰脑代谢成像。

为了解决这些挑战，研究人员在《Communications Biology》上发表了最新研究，开发了多模态无标记成像方法，用于全面评估三维工程化脑组织模型中的细胞代谢功能和动态相互作用。

研究人员主要采用了双光子荧光成像(TPEF)、荧光寿命成像(FLIM)和光谱成像等关键技术，使用人诱导神经干细胞(hiNSCs)、星形胶质细胞和小胶质细胞构建了三维丝素蛋白-胶原水凝胶脑组织模型。通过非负矩阵分解(NNMF)进行光谱分解，识别了NAD(P)H、脂酰胺脱氢酶(LipDH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和脂褐素等关键荧光团的光谱特征。建立了基于双波长激发的脂褐素识别和去除方法，并结合氧化还原比率(RR)、线粒体碎片化分析和荧光寿命测量等多参数评估代谢状态。

光谱分解识别关键荧光团及其激发/发射特征

研究人员通过分析755nm和860nm激发下获得的荧光发射光谱，使用非负矩阵分解成功识别出四种主要内源性荧光团的光谱特征。结果显示，脂褐素在两种激发波长下都有显著贡献，且其贡献随着培养时间增加而增加。通过比较不同荧光团在860nm与755nm激发下的效率比，建立了从有限波长图像中准确提取各荧光团贡献的方法，为后续代谢分析奠定了基础。

内源性TPEF强度代谢评估揭示神经元与胶质细胞的差异代谢特征

通过长达11周的持续监测，研究发现神经元表现出较高的氧化还原比率和较低的线粒体碎片化，表明其更强的OXPHOS活性。相比之下，星形胶质细胞和小胶质细胞显示出更相似的代谢功能读数，但星形胶质细胞在6-8周时线粒体碎片化较低，表明谷氨酰胺分解/OXPHOS活性增加。值得注意的是，神经元还显示出较高的脂褐素水平，表明由于其依赖OXPHOS和有限的抗氧化能力而面临更大的氧化应激。

脂褐素自发荧光显著影响光学代谢功能指标

研究特别强调了考虑脂褐素干扰的重要性。通过比较去除脂褐素前后RR和线粒体碎片化评估结果，发现脂褐素去除对线粒体碎片化评估影响最为显著。神经元含有比胶质细胞更多的脂褐素，在去除后显示出明显变化，特别是在中高RR组分方面。这些发现强调了脂褐素对脑细胞自发荧光的显著影响，并说明详细的光谱知识如何提高代谢功能指标的准确性。

无标记荧光寿命成像对人脑细胞抗氧化活性的敏感性

荧光寿命成像为代谢特征提供了补充信息。所有细胞特征都显示低G相量值普遍性降低，NAM神经元表现出低G值最大程度的降低，表明NADPH被谷胱甘肽抗氧化途径大量利用以支持ROS缓解。星形胶质细胞在初始和最终时间点比小胶质细胞表现出更高的NADPH池水平，能够在使用后补充其NADPH并维持高抗氧化活性。

光学代谢功能指标联合使用实现动态代谢途径可视化

通过结合12种光学代谢功能参数进行二次判别分析(QDA)，研究发现星形胶质细胞随时间变化最小，表明其可能灵活调动代谢途径以维持稳态。星形胶质细胞和小胶质细胞显示出重叠的代谢特征，而单一培养和三重培养中的神经元占据不同的QDA空间，反映了通过数据验证的途径差异。

本研究通过多模态无标记光学成像策略，成功实现了对三维工程化脑组织模型中细胞代谢功能的长期动态监测。研究的主要意义在于开发了准确识别和去除脂褐素干扰的方法，建立了基于内源性荧光的多参数代谢评估体系，并揭示了神经元与胶质细胞之间复杂的代谢相互作用。特别重要的是，研究发现星形胶质细胞通过提供代谢底物和抗氧化支持，显著增强了神经元对氧化应激的抵抗能力。

该研究建立的成像方法不仅能够捕获OXPHOS、糖酵解、谷胱甘肽途径和脂肪酸氧化等关键代谢途径的动态变化，还为研究脑疾病中的代谢功能障碍提供了强大工具。尽管使用的工程化脑组织模型缺乏血管结构等重要脑功能特征，但其可控的三维微环境、人类相关细胞组成和长期稳定性使其成为解析动态脑能量代谢和细胞间相互作用的独特平台。

这项研究为理解正常和疾病状态下脑细胞代谢提供了重要见解，特别是在神经元与胶质细胞代谢耦合方面。随着进一步的技术优化和模型完善，这种多模态无标记成像方法有望在神经退行性疾病研究、药物筛选和毒性测试等领域发挥重要作用，为开发针对脑代谢功能障碍的新型治疗策略奠定基础。