肌肉与大脑条件性Dmd基因敲除揭示肌营养不良蛋白在神经行为与肌肉功能中的关键作用

《Communications Biology》：Conditional Dmd ablation in muscle and brain causes profound effects on muscle function and neurobehavior

本研究针对杜氏肌营养不良症(DMD)中肌肉与神经行为共病的机制难题，通过构建条件性Dmd基因敲除小鼠模型，系统揭示了肌营养不良蛋白在骨骼肌和浦肯野神经元中的特异性功能。研究人员发现肌肉特异性Dmd敲除导致细胞外基质(ECM)重构和炎症通路激活，而小脑特异性敲除则引发社交记忆和空间记忆缺陷。该研究为DMD多系统病症提供了新的病理机制见解，对开发针对神经行为症状的靶向治疗策略具有重要意义。

　　

在医学研究领域，杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)一直是一个令人困惑的难题。这种X连锁遗传病不仅导致进行性肌肉萎缩和心功能衰竭，更令人惊讶的是，约三分之一的患者同时被诊断患有自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)。这种肌肉与神经系统症状的共病现象，引发了科学家对肌营养不良蛋白(dystrophin)多功能性的深入思考。

肌营养不良蛋白是细胞骨架与细胞外基质连接的关键蛋白，其编码基因DMD是人类最大的基因之一，跨度达2.4兆碱基。传统观点认为该蛋白主要表达于肌肉组织，但越来越多的证据表明，其在脑组织中同样具有重要功能。然而，由于DMD基因的复杂性和技术限制，研究人员一直难以精确解析肌营养不良蛋白在不同组织中的特异性功能。

为了解决这一难题，Matthew S. Alexander领导的研究团队在《Communications Biology》上发表了最新研究成果。他们采用CRISPR基因编辑技术，成功构建了条件性Dmd基因敲除小鼠模型，为揭示肌营养不良蛋白在肌肉和神经系统中的特异性功能提供了有力工具。

研究团队首先通过精准的基因编辑，在小鼠Dmd基因第52号外显子两侧插入loxP序列。这种设计使得在与组织特异性Cre重组酶系交配后，能够实现特定组织中的基因敲除。研究人员分别构建了骨骼肌特异性敲除(Dmd:HSA KO)和小脑浦肯野神经元特异性敲除(Dmd:Pcp2 KO)两种模型，系统评估了肌营养不良蛋白缺失对肌肉生理功能和神经行为的影响。

关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9技术构建条件性Dmd^flox52/Y小鼠模型；通过组织特异性Cre重组酶(HSA-Cre和L7/Pcp2-Cre)实现细胞类型特异性基因敲除；采用免疫印迹和免疫荧光技术检测蛋白表达；使用旋转棒、握力测试和跑步机评估肌肉功能；通过三室社交实验、T/Y迷宫和水迷宫分析神经行为；进行RNA测序分析转录组变化；应用心脏毒素诱导肌肉损伤模型评估再生能力。

生成和初步表征骨骼肌肌营养不良蛋白敲除小鼠

研究人员发现，骨骼肌特异性Dmd敲除小鼠表现出典型的肌营养不良病理特征。免疫印迹分析显示，胫骨前肌(TA)和比目鱼肌中Dp427m蛋白水平降至正常水平的5%以下。组织学分析揭示了明显的肌纤维变性、中央核化现象和胶原沉积。

肌肉横截面积(CSA)分析显示，敲除小鼠出现了更多小直径肌纤维，羟基脯氨酸含量显著升高，表明纤维化程度加剧。这些病理改变与经典的mdx小鼠模型相似，证实了该模型在模拟DMD肌肉病理方面的有效性。

骨骼肌纤维肌营养不良蛋白缺失严重损害肌肉生理功能

功能评估显示，Dmd:HSA KO小鼠在运动能力和肌肉力量方面存在明显缺陷。旋转棒实验显示跌落潜伏期延长，旷场试验中总运动距离减少，前肢握力显著下降。特别值得注意的是，在 downhill跑步机测试中，敲除小鼠表现出更快的衰竭时间、更短的运动距离和更低的速度。

体外肌肉收缩实验进一步证实，敲除小鼠的趾长伸肌(EDL)在生理横截面积归一化的峰值力量降低，对离心收缩的耐受性更差。这些结果明确了肌营养不良蛋白在维持肌肉收缩质量和机械稳定性中的关键作用。

肌营养不良蛋白肌纤维KO小鼠损伤后骨骼肌再生受损

肌肉卫星细胞(MuSCs)分析显示，Dmd:HSA KO小鼠中Pax7阳性细胞数量减少。心脏毒素诱导的肌肉损伤模型进一步证实，肌纤维肌营养不良蛋白缺失导致再生能力受损，表现为纤维化区域扩大、胶原沉积增加和坏死区域增多。损伤后14天和21天，敲除小鼠肌纤维中中央核化现象显著增加，表明肌肉再生过程异常。

肌营养不良蛋白肌纤维KO肌肉存在细胞因子和ECM通路紊乱

转录组分析揭示了1804个差异表达基因，其中1164个上调，640个下调。基因本体(GO)分析显示，上调基因显著富集于炎症反应、先天免疫反应和胶原纤维组织等通路。值得注意的是，Nos2(iNos)表达下调，而Tgfβ1等关键免疫细胞因子表达上调，反映了肌纤维与免疫细胞间信号通路的紊乱。

产后骨骼肌纤维肌营养不良蛋白缺失损害肌肉维持

研究人员利用他莫昔芬诱导型HSA-MerCreMer系统，在成年小鼠中特异性敲除肌营养不良蛋白。令人惊讶的是，诱导后2个月，肌肉中Dp427m蛋白仅减少25-30%，表明该蛋白具有显著的稳定性。尽管蛋白水平下降有限，但仍观察到肌纤维横截面积减小和最小直径减小，提示即使部分蛋白缺失也足以影响肌肉稳态。

小脑肌营养不良蛋白缺失损害神经行为功能

在神经系统方面，Dmd:Pcp2 KO小鼠小脑中Dp427蛋白水平降低约65%。行为学测试显示，这些小鼠在社交新颖性识别方面存在缺陷，在三室社交实验中对新旧小鼠无偏好差异。Y迷宫测试显示自发交替减少，Morris水迷宫中找到平台的时间延长，表明空间工作记忆受损。

研究结论强调，肌营养不良蛋白在骨骼肌和大脑中均具有不可或缺的生理功能。骨骼肌中肌营养不良蛋白缺失主要通过破坏细胞外基质稳态和炎症通路导致肌病，而小脑浦肯野神经元中该蛋白的缺失则直接引起神经行为缺陷。这一发现为理解DMD患者肌肉与神经精神共病提供了机制解释，强调了未来治疗策略需要同时针对这两个系统。

该研究的创新性在于首次使用条件性基因敲除技术，精确解析了肌营养不良蛋白在不同组织中的特异性功能。研究结果对优化肌营养不良蛋白替代基因治疗和外显子跳跃矫正策略具有重要指导意义，特别是提示了需要开发能够穿透血脑屏障的治疗方案，以实现对DMD多系统症状的全面治疗。