TMPRSS11E通过切割TFR1调控巨噬细胞铁代谢与IFN-γR2内化在先天免疫中的作用

《Communications Biology》：TMPRSS11E-mediated TFR1 cleavage influences IFN-γR2 internalization and the macrophage innate response

本研究揭示了炎症条件下巨噬细胞中丝氨酸蛋白酶TMPRSS11E通过切割转铁蛋白受体TFR1，释放可溶性TFR1（sTFR1），进而影响铁摄取和干扰素γ受体2（IFN-γR2）的内化过程。研究人员发现TMPRSS11E的表达在肺炎患者和LPS处理的动物模型肺泡巨噬细胞中上调，并通过调控TFR1介导的铁代谢，促进M1型巨噬细胞极化，增强IFN-γ-STAT1信号通路响应。该研究为理解炎症反应中铁稳态与先天免疫的交叉调控提供了新机制，并为相关肺部炎症疾病的治疗提供了潜在靶点。

　　

在免疫学的广阔图景中，巨噬细胞作为先天免疫的关键执行者，其功能状态的精细调控始终是研究的焦点。当病原体入侵或组织损伤发生时，巨噬细胞能够极化为促炎的M1型或抗炎的M2型，这一过程受到复杂信号网络的严密控制。干扰素-γ（IFN-γ）是诱导M1极化的核心细胞因子，其信号通路的强度直接影响炎症反应的进程。然而，科学家们发现，巨噬细胞对IFN-γ的响应存在显著差异，这种差异背后的分子开关却一直不甚明晰。

近年来，铁代谢与免疫功能的交织引起了广泛关注。铁是细胞增殖和功能执行不可或缺的元素，而转铁蛋白受体1（TFR1）是细胞摄取铁的主要门户。有趣的是，临床观察发现，在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和肺炎患者的肺泡灌洗液（BALF）中，可溶性TFR1（sTFR1）的水平显著升高，提示铁代谢紊乱与肺部炎症存在潜在联系。但sTFR1的产生机制及其免疫学意义仍是未解之谜。

另一方面，跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS11E（也称DESC1）的表达在炎症状态下的巨噬细胞中被诱导上调。东南大学李淑峰教授团队的前期工作表明，LPS（脂多糖）刺激可上调肺泡巨噬细胞中TMPRSS11E的表达，并加剧炎症反应。然而，TMPRSS11E在巨噬细胞免疫功能中的具体作用机制，特别是它是否以及如何参与调控铁代谢和IFN-γ信号通路，仍然是一个亟待探索的黑箱。

为了解决这些问题，李淑峰团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们发现TMPRSS11E能够特异性切割TFR1，释放sTFR1，从而减少巨噬细胞的铁摄取。这一过程进而抑制了IFN-γ受体2（IFN-γR2）的内化，使其更多地滞留于细胞膜上，最终增强了IFN-γ-STAT1信号通路的响应，促进了巨噬细胞向M1表型的极化。这项研究不仅揭示了炎症条件下sTFR1产生的新机制，更重要的是，它阐明了TMPRSS11E通过调控铁代谢，在连接先天免疫与细胞代谢重编程中扮演了关键角色。

为开展此项研究，作者运用了多种关键技术方法：通过免疫共沉淀结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选TMPRSS11E的相互作用蛋白；利用蛋白质印迹（Western Blot）和点突变技术验证TFR1为TMPRSS11E的直接作用底物及切割位点；构建稳定过表达TMPRSS11E及其催化失活突变体（S372A）的THP-1细胞系进行功能研究；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测临床肺炎患者（n=20）及对照（n=10）肺泡灌洗液（BALF）以及LPS处理的动物模型和细胞模型中的sTFR1水平；通过免疫荧光显微镜观察细胞表面IFN-γR2的内化情况及与内体标志物Rab5a的共定位；并使用细胞膜和内体分离技术验证蛋白分布。

TMPRSS11E与TFR1相互作用

研究人员首先通过免疫共沉淀联合质谱分析来寻找TMPRSS11E的潜在底物。

结果显示，转铁蛋白受体1（TFR1）被鉴定为与TMPRSS11E高置信度结合的蛋白。随后的免疫共沉淀和免疫印迹实验证实了TMPRSS11E与TFR1在HEK293T细胞中存在直接相互作用，这为后续研究TMPRSS11E对TFR1的切割作用奠定了基础。

TMPRSS11E切割TFR1

为了验证TMPRSS11E是否能切割TFR1，研究团队进行了体外切割实验。

他们将纯化的重组TMPRSS11E蛋白酶与重组Fc-TFR1蛋白或表达在细胞表面的TFR1共同孵育。蛋白质印迹分析表明，TMPRSS11E能够切割TFR1，并释放出约75 kDa的可溶性TFR1（sTFR1）片段到培养基中。通过构建催化活性位点突变体（S372A）和使用TMPRSS11E抑制剂，他们进一步证实TFR1的切割依赖于TMPRSS11E的蛋白酶活性。当蛋白酶活性被抑制时，sTFR1的释放显著减少，细胞表面的全长TFR1水平相应升高。

TMPRSS11E在TFR1的R100位点进行切割

由于TMPRSS11E倾向于切割底物的碱性氨基酸残基，研究人员对TFR1胞外域中推测的切割位点进行了点突变分析。

他们将TFR1第100位的精氨酸（R100）和第121位的精氨酸（R121）分别突变为丙氨酸（A）。结果表明，R100A突变几乎完全阻断了TMPRSS11E介导的sTFR1释放，而R121A突变则无影响。这证明R100是TMPRSS11E切割TFR1的关键位点。

炎症条件下TMPRSS11E表达上调并促进sTFR1释放

为了探究TMPRSS11E和TFR1切割的病理意义，研究团队检测了临床样本和疾病模型中的相关指标。

在肺炎患者的肺泡灌洗液（BALF）肺泡巨噬细胞中，TMPRSS11E的表达显著高于对照组，同时BALF中sTFR1的浓度也明显升高。在LPS诱导的大鼠和小鼠肺部炎症模型中，也观察到了类似的现象：肺泡巨噬细胞TMPRSS11E表达上调，BALF中sTFR1水平增加。此外，在LPS处理的小鼠腹腔巨噬细胞和人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞中，TMPRSS11E的表达和sTFR1的释放均被诱导，且sTFR1的增加可被TMPRSS11E抑制剂所逆转。这些结果强有力地表明，在炎症环境下，巨噬细胞中TMPRSS11E的表达上调导致了TFR1的切割和sTFR1的释放。

TMPRSS11E影响巨噬细胞表面TFR1和IFN-γR2水平

为了深入理解TMPRSS11E的功能，研究团队构建了稳定过表达TMPRSS11E或其催化失活突变体（S372A）的THP-1细胞系。

与对照组或突变体细胞相比，过表达野生型TMPRSS11E的细胞对Alexa-488标记的转铁蛋白（Tf）的摄取能力显著降低，表明其细胞表面的TFR1水平下降，蛋白质印迹结果也证实了这一点。这种效应依赖于TMPRSS11E的蛋白酶活性，因为抑制剂处理可以恢复TFR1的水平。

更为重要的是，研究发现TMPRSS11E过表达影响了干扰素-γ受体2（IFN-γR2）的分布。

免疫荧光和细胞组分分离实验显示，在TMPRSS11E过表达的细胞中，IFN-γR2在细胞膜上的定位增加，而与其内体标志物Rab5a的共定位减少，表明IFN-γR2的内化过程受到抑制。相应地，当用IFN-γ刺激时，这些细胞表现出更强的STAT1磷酸化和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，意味着对IFN-γ的信号响应更为强烈。

TMPRSS11E在M1型巨噬细胞极化中特异性诱导表达

研究人员进一步探讨了TMPRSS11E在巨噬细胞不同极化状态下的表达模式。

当THP-1来源的巨噬细胞在LPS和IFN-γ刺激下向M1表型极化时，TMPRSS11E的表达被特异性诱导，同时细胞内的TFR1水平下降，转铁蛋白摄取减少。相反，在IL-4诱导的M2极化过程中，未检测到TMPRSS11E的表达，且TFR1水平较高。与此一致，M1型巨噬细胞表现出细胞膜上IFN-γR2的积累增强，预示着其对IFN-γ信号的高反应性。

铁摄取调控IFN-γR2内化

为了直接验证铁代谢对IFN-γR2内化的影响，研究团队在巨噬细胞极化过程中操纵了细胞的铁水平。

他们使用铁螯合剂去铁胺（DFO）降低细胞内铁浓度，或用枸橼酸铁铵（FAC）增加铁负荷。结果显示，在低铁条件下（DFO处理），细胞膜上的IFN-γR2增多，与Rab5a的共定位减少，STAT1磷酸化和iNOS表达增强。而在高铁条件下（FAC处理），则观察到相反的趋势，IFN-γR2更多地内化至胞内，IFN-γ信号响应减弱。这明确表明，铁摄取通过调控IFN-γR2的内化，精细调节着巨噬细胞的极化状态和炎症反应强度。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了丝氨酸蛋白酶TMPRSS11E在巨噬细胞介导的炎症反应中的一个全新功能机制。

如图9所示，在炎症信号（如LPS）刺激下，巨噬细胞中TMPRSS11E表达上调。活化的TMPRSS11E切割细胞膜上的转铁蛋白受体TFR1，导致可溶性TFR1（sTFR1）释放入细胞外环境，这可能是炎症状态的一个生物标志物。TFR1的切割减少了巨噬细胞通过TFR1介导的铁摄取。铁摄取的减少进而抑制了IFN-γ受体2（IFN-γR2）的内化过程，使得更多的IFN-γR2滞留于细胞膜上。这最终增强了巨噬细胞对IFN-γ的敏感性，促进了STAT1信号通路的激活，并驱动巨噬细胞向促炎的M1表型极化。

该研究的创新性在于首次发现TMPRSS11E是巨噬细胞中TFR1的关键切割酶，解析了sTFR1在炎症条件下产生的新机制；揭示了TMPRSS11E-TFR1-铁代谢轴能够通过调控IFN-γR2的内化，精细调节IFN-γ信号通路，从而将细胞代谢（铁稳态）与先天免疫应答紧密联系起来；明确了TMPRSS11E在促进M1型巨噬细胞极化中的重要作用，为理解炎症反应的调控网络增添了新的环节。这些发现不仅深化了对肺部炎症等疾病发病机制的认识，也为开发以TMPRSS11E为靶点的抗炎治疗策略提供了重要的理论依据和新的思路。