贝叶斯推断揭示同源三聚体配体门控离子通道P2X2的功能不对称性及其变构门控机制

《Communications Biology》：Bayesian inference of functional asymmetry in the homotrimeric ligand-gated ion channel P2X2

本刊推荐：为解析经典“翻转态”的结构基础及P2X2受体负协同性的物理起源，研究人员开展了结合贝叶斯推断（MacroIR）、膜片钳动力学与原子模拟的主题研究。结果表明，P2X2通过顺序、不对称的变构耦合机制激活，ATP结合选择性降低一个亚基的旋转能垒，触发部分激活并导致后续结合受阻，从而解释了负协同性及自发电流波动。该研究颠覆了对称协同门控的传统观点，为多聚体离子通道的动态变构调控提供了新范式。

　　

在神经传递、肌肉收缩和免疫防御等生命过程中，配体门控离子通道（Ligand-gated ion channels, LGIC）扮演着关键角色。其中，由ATP激活的P2X受体家族以其独特的三聚体结构和明确的亚基间ATP结合口袋，为研究变构门控机制提供了一个极简且易于操作的分子平台。尽管科学家们已经获得了P2X2受体关闭和开放状态的精细结构图谱，但长期以来，领域内面临着一个核心困境：经典的动力学模型常常依赖于诸如“翻转态”（flip state）这样的抽象中间态来解释快速配体结合与较慢孔道开放之间的动力学差异，然而这些中间态缺乏清晰的结构或能量基础。这一脱节在P2X2中尤为突出，其结构上的三重对称性预示着亚基行为的等效性，但电生理实验却反复揭示了功能上的不对称性和负协同性。由于每个ATP结合位点由两个相邻亚基共同构成，部分配体占据可能优先影响其中一个亚基的构象变化，但宏观电流信号往往将这些细微的动力学特征模糊化为粗糙的时间平均响应，使得揭示其内在的物理机制充满挑战。

为了攻克这一难题，并深入理解P2X2受体的门控原理，一项发表在《Communications Biology》上的研究应运而生。研究人员独辟蹊径，将高精度的膜片钳电生理记录、先进的贝叶斯统计推断与原子尺度的分子动力学模拟相结合，旨在揭示P2X2同源三聚体在对称结构下产生功能不对称性的物理起源。

研究人员首先设计了九个涵盖经典状态模型、经典变构模型以及显式耦合三个亚基旋转的构象模型等不同复杂程度的动力学机制方案。他们利用大鼠P2X2通道在0.2毫秒ATP脉冲（0.1-10 mM）刺激下获得的外面向外膜片钳记录数据，通过自主研发的MacroIR（宏观区间递归）算法进行贝叶斯模型选择。MacroIR算法的核心优势在于其能够递归地传播跨任意积分窗口的系综矩，从而得到高精度的区间平均似然估计，严格处理了宏观电流中不可避免的时间平均效应和相关结构，避免了传统方法因忽略这些因素而导致的偏差。模型证据通过在对数似然梯度的温度积分获得，成为比较候选模型的黄金标准。后验采样则采用了仿射不变并行回火马尔可夫链蒙特卡洛（PT MCMC）方法，高效地探索了复杂的多峰后验分布空间。

贝叶斯动力学方案选择结果显示，一个包含不对称亚基耦合的构象方案（方案IX）被决定性地区选出来，其贝叶斯因子超过其对称对应方案（方案VIII）5000倍以上。这一结果确立了以下关键点：1. 亚基旋转是激活过程中的主要构象步骤；2. ATP结合变构地调节结合界面处的旋转倾向性；3. 这种调节在亚基之间表现出强烈的不对称性；4. 宏观电导与旋转亚基的数量成比例。值得注意的是，经典的“翻转态”在此被重新诠释为底层亚基转变的概率性表现。

对优选方案IX的后验参数分布进行分析，发现参数可分为三类：核心动力学和噪声参数（如结合速率b_on、解离速率b_off、旋转速率r_on、r_off、单通道电导γ等）被数据强约束，呈现窄而单峰的后验分布；电导缩放参数（如闭合通道泄漏比p_leak、旋转-电导耦合因子R_y）受到中等程度的约束；而连接ATP结合与亚基旋转的耦合常数则表现出明显的双峰分布，这反映了宏观电流数据本身无法区分在给定结合口袋处哪个亚基受到更强的变构效应，即存在左-右耦合的简并性。

为解析上述耦合简并性，研究人员进行了互补性的微秒级分子动力学模拟。他们模拟了在单个结合口袋（A-B界面）中预结合了一个ATP分子的P2X4（与P2X2高度同源）闭合状态受体。通过分析关键胞外区域（头环Head-loop、左鳍状物LF、背鳍DF、下体LB）的闭合到开放过渡程度（DCOT）和方向对齐程度（DCOD），发现ATP结合后，构成结合裂隙的A链各区域向开放构象移动的程度显著大于B链的相应区域。例如，A链的LF分布明显向开放状态偏移，这引发了其与B链DF相互作用模式的改变，从而促进了B链DF的初始“释放”和运动。这种不对称的结构重排与动力学分析推测的结合后不对称耦合完全一致。基于此，研究人员将后验样本重新标记，将更强的耦合（RB）分配给A链，较弱的耦合（BR）分配给B链，从而将双峰后验分布坍缩为可解释的单峰形式。

不对称的过渡能垒调制

为了理解ATP结合如何重塑P2X2门控的能量景观，研究人员建模了三个耦合的转变：配体结合、左侧亚基（A亚基）旋转和右侧亚基（B亚基）旋转。后验分布显示，ATP结合强烈加速了A亚基的旋转，但对B亚基的影响微乎其微。同样，A亚基的旋转显著增加了ATP的结合速率（RB_bon >> 1），而B亚基的旋转则产生微弱甚至抑制性的效应（BR_bon < 1）。这些模式揭示了一种显著的功能不对称耦合。对耦合因子的对数-对数分析进一步区分了变构机制模式：ATP对A亚基的影响体现了催化型变构（同时增强开启和关闭速率，降低活化能垒），而对B亚基的BR耦合则很弱。这种不对称的能垒调节为顺序、有序的亚基激活提供了机制上的解释。

整合亚基构象动力学到通道动力学中

为了定量地将亚基水平的构象动力学与宏观通道行为联系起来，研究人员构建了一个显式表示所有亚基结合和旋转状态组合的马尔可夫模型。该模型预测，在无配体条件下（ATP移除后60秒），随机波动驱动了部分激活态的非 negligible 占据率：约15%的通道有一个亚基旋转，约1.1%有两个亚基旋转。因此，在膜片钳实验中观察到的自发基线电流被定量地归因于向这些部分激活态的转变，而非仅仅是测量噪声。在ATP刺激（10 mM脉冲）期间，状态占据率顺序演化：配体结合先于亚基旋转。至关重要的是，模型揭示具有两个旋转亚基的通道可传导最大电流的34%（26-45%等尾区间），证实部分激活具有生理学意义。

动力学模型的后验预测电流验证

通过比较模型生成的宏观电流与实验记录，研究人员验证了模型的预测能力。从后验分布中抽取的样本紧密地再现了测量宏观响应的幅度和时间过程。模型还定量地解释了在施加ATP之前观察到的自发电流波动，将基线活动归因于向部分激活态的转变。MacroIR进一步将每个时间点的总观测方差分解为三个独立部分：随机通道门控产生的方差、白噪声和粉红噪声。模型预测与实验观测之间的似然比较显示出极好的一致性。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：基于外面向外膜片钳技术的快速ATP脉冲刺激与高信噪比电流记录；自主研发的MacroIR贝叶斯推断算法，用于从时间平均的宏观电流中进行动力学参数估计和模型选择；仿射不变并行回火马尔可夫链蒙特卡洛（PT MCMC）后验采样；以及基于AMBER软件的分子动力学模拟，用于分析单ATP结合状态下P2X受体的结构动力学。

本研究结论与讨论部分指出，尽管P2X受体具有完美的三重对称性，但其功能行为并非等效三聚体。ATP结合到任何一个对称等效的亚基间口袋，会优先降低A亚基的旋转能垒，而对B亚基的影响甚微或略有不利。A亚基的早期旋转扭曲了其邻近的、它也参与构成的口袋，提高了该处ATP结合的自由能垒，从而为负协同性提供了结构基础。无配体状态下升高的能垒稳定了关闭构象，但仍允许罕见的、向部分旋转态的偏移，这定量地解释了在外面向外膜片记录中检测到的自发开放。研究将经典的“翻转态”重新定位为不对称能垒调制的必然结果，从而将三聚体P2X受体中的变构重新定义为对过渡路径的动态控制，而非状态间的静态平衡转移。这种有序、不对称的激活机制缩小了熵搜索空间，防止了同时发生的风险转变，并在并非所有结合位点都被占据时产生分级电导，这些特征都可能增强快速的突触信号传递。能垒调节可能也控制着其他多聚体通道和变构机器，其中部分激动和负协同性很常见。因此，绘制亚基特异性的能垒为开发理性的、亚基选择性的调节剂开辟了道路，这些调节剂可以调整门控动力学，而非靶向静态构象。这项研究结合了高精度电生理学、区间精确贝叶斯推断和结构信息模拟的整合策略，为揭示三聚体配体门控通道中潜在的机制秩序提供了一个可检验的假设和方法学模板，可能指导未来在其他寡聚蛋白质组装体中的实验研究。