外泌体途径线粒体成分释放受阻促进Fuchs角膜内皮营养不良发病机制

《Cell Death Discovery》：Blockade of mitochondrial components release by exosome pathway promotes the pathogenesis of Fuchs endothelial corneal dystrophy

本研究针对Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)发病机制不清的问题，通过4D标记自由定量蛋白质组学分析早期/中期FECD患者房水(AH)蛋白质谱变化，发现线粒体成分显著富集。研究证实角膜内皮细胞(CECs)通过外泌体(EVs)释放受损线粒体成分，当外泌体生物发生被GW4869抑制时，会加剧细胞死亡和线粒体膜电位(ΔΨm)损伤。该研究为FECD的早期防治提供了新靶点。

　　

在眼科疾病领域，Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）是一种全球范围内导致角膜移植的主要病症。这种疾病主要表现为角膜内皮细胞（CECs）的进行性丧失，伴随细胞凋亡、形态改变、细胞密度下降以及角膜后弹力层（DM）上出现疣状突起（guttae）。FECD通常在中年以后发病，女性发病率较高，其发病机制涉及遗传易感性和环境因素的复杂交互作用。以往研究多聚焦于角膜内皮细胞本身的变化，而对其微环境——房水（AH）在疾病发生发展中的作用关注不足。房水作为眼前节无血管组织的重要支持液，不仅维持眼压，还可能调控多种眼部疾病的发生。尤其值得注意的是，线粒体功能障碍在FECD中的作用日益受到重视。角膜内皮细胞含有丰富的线粒体，为钠钾泵（Na⁺/K⁺-ATPase）功能提供能量。在FECD中，线粒体呈现分裂为主的形态，密度降低，这与线粒体自噬（mitophagy）上调有关。然而，受损线粒体的最终去向，特别是是否通过细胞外囊泡（EVs）释放到细胞外，在FECD中尚不明确。

为了深入探究FECD的发病机制，特别是早期阶段的分子变化，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了最新研究成果。他们创新性地将研究视角从细胞分析转向房水蛋白质组分析，旨在揭示FECD患者房水中的蛋白质变化，并详细探讨房水与角膜内皮细胞之间的相互作用关系。

研究团队主要运用了4D标记自由定量蛋白质组学技术分析房水样本，结合酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光染色、透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质印迹（WB）、线粒体DNA（mtDNA）拷贝数分析、线粒体示踪病毒转染、细胞活性检测（Live-Dead assay）和线粒体膜电位（JC-1）测定等一系列关键技术。临床样本来源于山东眼科医院的7例早中期FECD合并白内障患者和6例年龄匹配的老年性白内障对照患者。同时，研究还建立了非遗传性FECD小鼠模型（通过UVA照射角膜）并使用了人角膜内皮细胞（HCECs）系（B4G12）进行体外实验。

研究结果

Demographic data

研究人员首先对FECD患者和对照组患者的角膜内皮形态进行了详细比较。通过裂隙灯显微镜、角膜光学相干断层扫描（OCT）、角膜内皮镜和共聚焦显微镜检查，证实FECD患者存在典型的角膜内皮异常，包括中央角膜增厚、后弹力膜表面高密度疣状物、内皮细胞密度显著降低以及细胞面积变异增大。定量分析显示，FECD组的角膜内皮细胞密度（CD）为1643.00±303.94 cells/mm²，显著低于对照组（P<0.001）；中央角膜厚度（CCT）也显著高于对照组（P=0.028）。这些数据为后续的蛋白质组学研究提供了可靠的临床表型基础。

Proteomic profiling and functional enrichment analysis of aqueous humor from FECD and control patients

通过对房水样本进行4D标记自由定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究共鉴定出1613种蛋白质，其中72种为差异表达蛋白（DEPs）。在FECD组中，44种蛋白质表达上调超过两倍，28种蛋白质表达下调至少两倍。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，上调蛋白主要富集于Hippo信号通路、三羧酸循环（TCA cycle）、坏死性凋亡（necroptosis）和细胞周期等通路；下调蛋白则主要与溶酶体（lysosome）以及蛋白质消化吸收相关。亚细胞定位预测发现，上调蛋白中20.45%被注释为线粒体蛋白，而下调蛋白中线粒体蛋白仅占7.14%。这种蛋白质分布的变化，特别是线粒体成分在FECD房水中的显著富集，提示线粒体功能紊乱在FECD发病中扮演重要角色。

The identification of upregulated mitochondrial components in AH during FECD pathogenesis

为了进一步验证蛋白质组学结果，研究人员对差异表达蛋白进行了分层聚类分析。他们将DEPs根据表达差异倍数分为四组（Q1-Q4），发现Q4组（表达上调>2倍）的蛋白显著富集于线粒体成分和线粒体功能相关条目。随后，他们选择了三个关键的线粒体蛋白——主要位于线粒体内膜的溶质载体家族25成员3（SLC25A3）、位于线粒体基质的丙酮酸羧化酶（PC）和帕金森病相关deglycase（PARK7）进行ELISA验证。结果证实，这三种线粒体蛋白在FECD患者房水中的浓度均显著上调，与蛋白质组学数据一致，有力地支持了线粒体成分在FECD发病机制中上调的可靠性。

More release of mitochondrial proteins outside the cell during FECD pathogenesis

接下来，研究转向探究线粒体成分在细胞外的潜在作用。他们首先评估了角膜内皮细胞中的线粒体损伤情况。免疫荧光染色显示，线粒体外膜标志物TOM20在健康角膜内皮细胞中核周表达强阳性且分布密集，而在FECD患者中，其表达显著减少且分布稀疏。在UVA照射诱导的FECD小鼠模型中，也观察到了类似的TOM20表达下降和内皮细胞密度减少的现象。为了追踪线粒体动力学，研究人员用Mito-GFP慢病毒转染人角膜内皮细胞，并施加UVA照射。结果显示，对照组中线粒体主要密集分布于核周，而FECD组中则观察到线粒体有向细胞外转移的趋势。这些发现促使研究者进一步探究线粒体在FECD发病过程中的空间定位和释放形式。

Enhanced release of extracellular mitochondria in FECD endothelial cells

透射电子显微镜（TEM）分析揭示，UVA照射后的人角膜内皮细胞外有大量的细胞外囊泡（EVs）积聚，提示线粒体可能通过囊泡形式释放。研究人员通过超速离心法分离了细胞外囊泡，并通过TEM、NTA和WB对其进行了鉴定。从UVA照射和未照射的人角膜内皮细胞中分离的外泌体均呈现典型的杯状或圆形结构，表达标志蛋白CD63和TSG101。最关键的是，线粒体DNA（mtDNA）拷贝数分析显示，UVA照射后的人角膜内皮细胞内mtDNA拷贝数显著降低，而同期从其分离的外泌体（UVA-Exo）中mtDNA拷贝数（包括MT-COX1、MT-ND1和MT-ND6基因）却显著增加。这表明在FECD条件下，角膜内皮细胞确实通过外泌体向细胞外释放了更多的线粒体成分。

Aggravated cell death and reduced mitochondrial membrane potential in FECD endothelial cells with inhibition of exosome biogenesis

为了验证外泌体释放途径的功能重要性，研究人员使用GW4869（一种中性鞘磷脂酶nSMase抑制剂，可阻断外泌体生物发生）处理人角膜内皮细胞。结果显示，单独UVA照射引起少量细胞损失，而UVA联合GW4869处理则导致人角膜内皮细胞数量明显减少，细胞皱缩变圆。Live-Dead细胞活性检测表明，GW4869处理显著增加了UVA照射细胞的死亡比例。JC-1染色评估线粒体膜电位（ΔΨ_m）发现，未处理细胞以红色荧光（JC-1聚集体）为主，表明线粒体膜电位正常；UVA照射后绿色荧光（JC-1单体）增强，表明膜电位去极化；而UVA加GW4869处理的细胞红色荧光最弱，绿色荧光最强，表明线粒体功能障碍最为严重。这些结果综合表明，阻断外泌体生物发生会加剧FECD角膜内皮细胞的死亡和线粒体功能障碍。

研究结论与意义

本研究通过系统的蛋白质组学、细胞生物学和分子生物学方法，首次揭示了早中期FECD患者房水中线粒体成分显著上调的现象，并深入阐明了角膜内皮细胞通过外泌体途径释放受损线粒体成分作为一种重要的线粒体质量调控机制。在生理状态下，角膜内皮细胞可能少量释放受损线粒体以维持稳态；而在FECD相关的过度氧化应激条件下，这一过程被增强，以应对累积的线粒体损伤。当该释放途径被抑制时（如使用GW4869），细胞清除受损线粒体的能力下降，从而导致线粒体功能障碍加剧和细胞死亡增加。

这项研究的创新之处在于将FECD的研究视角从细胞内部拓展到了细胞外微环境（房水），并首次提出角膜内皮细胞在生理和病理条件下均能通过外泌体释放线粒体成分。这不仅为理解FECD的发病机制提供了全新的视角（即细胞通过主动“排出”受损细胞器来应对应激），也为开发FECD的早期诊断生物标志物（如房水中的线粒体蛋白）和非侵入性治疗策略（如调控外泌体释放途径）奠定了重要的理论基础。由于FECD进展缓慢，针对早期阶段的干预尤为重要，本研究发现的机制为在疾病早期进行干预，延缓或阻止其进展带来了希望。未来研究可以进一步详细解析线粒体成分释放的具体分子机制，以及这些释放到房水中的线粒体成分是否会对周围细胞产生反馈调节作用，从而更深层次地揭示FECD的复杂病理过程。