通过工程改造的细胞外囊泡介导的焦亡作用实现三阴性乳腺癌的免疫学转化

《Journal of Controlled Release》：Immunological conversion of triple-negative breast cancer by engineered extracellular vesicle-mediated pyroptosis

靶向递送系统激活三阴性乳腺癌细胞焦亡并重塑免疫微环境。通过双纳秒脉冲微流控电穿孔技术制备的工程外泌体（pTGDEV）共载Gasdermin E N端（GSDME-N）mRNA和DDR1短发夹RNA，利用pH响应肽（GALA）和CD156抗体实现酸性肿瘤微环境特异性释放。该系统诱导肿瘤细胞焦亡并抑制DDR1介导的免疫排斥，显著抑制小鼠原位和患者来源的TNBC模型肿瘤生长，延长生存期，同时促进树突状细胞和T细胞浸润，将免疫抑制微环境转为激活状态。该策略为三阴性乳腺癌免疫治疗提供了精准递送新范式。

　　

张欢|孙曼|陈嘉毅|王思淼|刘嘉毅|杨洪群|刘洛通|胡思远|杨芳|滕乐生|陈洲|王晓兵|董世彦|马一帆|贾里德·L·爱德华兹|王晓天|张彦祖|金贝蒂·Y.S.|姜文|崔亚欣|杨兆刚

吉林大学生命科学学院，长春130012，中国

摘要

尽管焦亡已成为三阴性乳腺癌（TNBC）免疫治疗的一种有前景的策略，但其临床应用仍受到系统性脱靶毒性和显著免疫排斥的阻碍。为了解决这些问题，我们开发了一种高通量双纳秒脉冲微流控电穿孔系统，用于生成工程化细胞外囊泡（GDEV）。这些细胞外囊泡分别包裹了gasdermin E N末端（GSDME-N）mRNA以诱导焦亡，以及discoidal domain受体1（DDR1）shRNA以抑制免疫排斥。通过对临床TNBC样本的蛋白质组学分析，我们确定了CD156作为TNBC特异性表面生物标志物。为了实现肿瘤特异性递送并最小化脱靶效应，GDEV进一步被改造为携带抗CD156抗体和GALA pH敏感肽的pTGDEV。在酸性的肿瘤微环境中，pTGDEV能够精确释放其治疗载荷，同时激活焦亡信号通路并减轻免疫排斥。在原位小鼠TNBC模型和患者来源的异种移植模型中，pTGDEV显著抑制了肿瘤进展并延长了中位生存期。pTGDEV治疗还减少了髓系来源的抑制细胞数量，同时增强了树突状细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的浸润，有效将肿瘤微环境从免疫抑制型转变为免疫刺激型。这些结果表明，pTGDEV为TNBC免疫治疗提供了一种强大且具有针对性的方法，具有显著的临床应用潜力。

引言

癌症免疫治疗已成为一种关键的治疗手段，在多种恶性肿瘤中显著提高了患者的生存率[1,2]。然而，临床效果仍然不稳定，仅有15–25%的患者能够实现持久缓解，这主要是由于存在高度免疫抑制的肿瘤微环境（iTME）[3],[4],[5]。从机制上讲，有效的抗肿瘤免疫需要癌症-免疫循环中多个阶段的协调进展，包括免疫原性细胞死亡、树突状细胞（DC）成熟和抗原呈递、肿瘤引流淋巴结中的T细胞激活以及效应免疫细胞向肿瘤组织的浸润[6,7]。这些发现强调了迫切需要新型策略来强烈刺激抗肿瘤免疫反应。

焦亡是一种由gasdermin（GSDM）蛋白介导的程序性细胞死亡形式，已成为癌症免疫治疗的一种有前景的策略[8,9]。焦亡的特点是膜孔形成、细胞肿胀和细胞质内容物的释放，它能引发强烈的促炎信号并增强肿瘤抗原的呈递[10,11]。在三阴性乳腺癌（TNBC）中，即使低水平的焦亡性肿瘤细胞死亡也能触发强烈的免疫激活，有效“激活”肿瘤微环境（TME），从而提高免疫治疗的疗效[12],[13],[14],[15],[16]。然而，基于焦亡的疗法在TNBC中的临床转化仍然有限。大多数诱导焦亡的试剂设计复杂且肿瘤特异性较差[15,17]。GSDM在健康组织中的非特异性激活会导致由于正常细胞膜中孔洞形成失控而引起的系统性炎症和器官损伤。此外，TNBC中密集且具有免疫抑制性的细胞外基质（ECM）对免疫细胞浸润构成了物理障碍。异常的胶原交联，部分由discoidin domain受体1（DDR1）的过表达介导，会促进免疫排斥并严重限制免疫治疗的疗效[1,18]。不幸的是，以往针对ECM清除的策略在改善TNBC肿瘤中的免疫细胞浸润方面效果有限[19,20]。这些挑战突显了迫切需要一种能够诱导焦亡的同时克服ECM介导的免疫排斥的靶向纳米医学。

在此，我们开发了一种双纳秒脉冲微流控电穿孔系统（dnsPMEs），用于高通量生成工程化细胞外囊泡（GDEV）。这些GDEV同时包裹了gasdermin E N末端（GSDME-N）mRNA和针对DDR1的shRNA。当GDEV被TNBC细胞内化后，GSDME-N mRNA会被翻译成功能性蛋白质，通过膜孔形成和危险相关分子模式（DAMPs）及促炎细胞因子的释放来诱导焦亡。同时，DDR1 shRNA会沉默DDR1的表达，从而减轻ECM驱动的免疫排斥。为了实现肿瘤特异性递送，我们通过临床样本的蛋白质组学分析确定了CD156作为TNBC特异性表面生物标志物。此外，我们利用了GALA肽的pH响应特性，该肽在生理pH下为可溶性随机卷曲结构，在酸性条件下转变为破坏膜的双亲α-螺旋结构，从而在酸性肿瘤微环境中促进载荷的释放[21,22]。通过将GDEV表面改造为携带抗CD156抗体和GALA肽，我们设计出了一种能够选择性递送的肿瘤靶向细胞外囊泡（pTGDEV）。在本研究中，我们证明了pTGDEV能够在小鼠和患者来源的TNBC模型中有效诱导焦亡、减轻免疫排斥并增强免疫治疗效果（图1）。这一集成平台为mRNA和shRNA的共递送、肿瘤特异性治疗以及TNBC治疗中的免疫调节提供了一种有前景的策略。

材料

细胞培养基（包括Roswell Park Memorial Institute-1640培养基（RPMI-1640）、Dulbecco改良基本培养基（DMEM）以及胰蛋白酶）购自SenBeiJia生物科技有限公司（南京，中国）。胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素溶液购自Gibco（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。BCA蛋白定量试剂盒、lipofectamine 3000转染试剂以及一些流式抗体（Fixable Viability Dye eFluor? 780、抗CD45-eFluor）

确定TNBC的靶向标志物

TNBC中缺乏有效的分子靶点仍然是治疗成功的重要障碍[36]。为了识别TNBC特异性靶点，我们对七名TNBC患者的肿瘤组织与其相邻的非肿瘤组织进行了全面的蛋白质组学分析。共鉴定出11,052种可量化的蛋白质（图S1）。其中，3882种蛋白质的表达发生了显著变化，变化倍数≥2.0且p值<0.05。

讨论

在本研究中，我们开发了一种基于EV的药物递送系统平台（pTGDEV），其中富集了大量GSDME-N mRNA/DDR1 shRNA。pTGDEV的表面进一步被改造为携带GALA pH敏感肽和CD156抗体，从而促进其优先被TNBC细胞内化。这种靶向摄取引发了细胞焦亡，减轻了免疫细胞的排斥，并重新编程了肿瘤微环境（TME），从而实现了有效的肿瘤生长抑制。

焦亡是一种成熟的...

CRediT作者贡献声明

张欢：撰写原始草稿、数据管理、概念构思。孙曼：撰写原始草稿、数据管理、概念构思。陈嘉毅：方法学设计、实验研究、概念构思。王思淼：方法学设计、实验研究、概念构思。刘嘉毅：方法学设计、实验研究、概念构思。杨洪群：方法学设计、实验研究、概念构思。刘洛通：实验研究、概念构思。胡思远：方法学设计、概念构思。杨芳：方法学设计、实验研究

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：82572406、823B2097）、吉林省科学技术委员会（资助编号：20250206003ZP）、吉林大学研究生创新基金（资助编号：2025CX129）以及吉林大学博士生研究与创新提升计划（资助编号：2025KC038）的支持。此外，我们还要感谢BioRender的支持。图1使用了BioRender.com生成。