综述：现代细胞外囊泡分离与提取技术的最新进展

《Journal of Chromatography A》：Recent advances in modern extracellular vesicle isolation and separation techniques

外泌体（EVs）作为细胞间通信的重要载体，其高效分离与纯化技术对诊断和治疗的临床转化至关重要。本文系统综述了EV分离技术的最新进展，涵盖尺寸、电荷和亲和力三大类方法。尺寸排除色谱（SEC）因高纯度和可调节孔径成为主流，但存在脂蛋白共沉淀问题，需结合超滤（UF）或免疫亲和色谱（IAC）优化。电泳和流场荧光分数法（FFF）等新兴技术通过电荷或电场效应实现高分辨率分离，但设备复杂性和操作难度限制了广泛应用。亲和力方法如免疫磁珠分离和纳米抗体捕获，特异性强但成本高且易受样本基质影响。研究强调单一技术难以满足临床需求，多技术联用（如TFF-IAC、SEC-FFF）可显著提升EV纯度与产量。此外，植物和细菌来源EVs的分离技术及工业级制备挑战也得到探讨。未来需开发标准化流程和模块化设备以实现规模化生产。

　　
外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要载体，近年来在疾病诊断和靶向治疗领域备受关注。本文系统综述了EV分离与纯化的技术进展，重点分析了尺寸、电荷及亲和力三大类别的现代技术，并探讨了多技术联用的发展趋势。

### 一、技术发展背景与核心挑战
EVs直径介于30-500 nm，携带核酸、蛋白质及脂质等多种生物活性分子。其异质性体现在来源（细胞、细菌、植物）、尺寸分布（exomeres<50 nm，supermeres<30 nm）、表面电荷（负电为主）及膜蛋白组成（如CD63、CD81）等方面。这些特性导致传统分离技术（如超速离心）存在局限性，主要表现为：
1. **纯度不足**：血浆样本中脂蛋白（如LDL、VLDL）与EV尺寸重叠（均约30-200 nm），常规密度梯度离心易共沉淀。
2. **产量波动**：复杂生物样本（如血清）中EV浓度低（10^8-10^10 particles/mL），传统UC耗时长达24小时。
3. **功能损伤风险**：高剪切力（UC）可能导致EV膜蛋白构象改变，影响其生物活性。

### 二、主流分离技术对比分析
#### （一）尺寸排阻技术（Size-Based Techniques）
1. **尺寸排阻色谱（SEC）**：
- 原理：基于分子流体力学半径差异，使用多孔介质（如Sephadex）实现分离。
- 优势：分辨率高（ΔD <5 nm），可结合在线检测（MALS、DLS）实现实时监控。
- 局限：孔径分布不均易导致峰展宽；血浆样本中脂蛋白（如ApoB-100）与EV尺寸重叠，需联合其他技术。
- 改进方案：
- **多级联用**：如UF（超滤）预浓缩后接SEC，可提升血浆样本中EV回收率30%-50%。
- **膜材料优化**：新型疏水材料（如PSG柱）可将ApoB-100去除率提升至99.6%。
- **微流控平台**：24孔板式SEC系统处理血浆时，纯度达82.8%，耗时缩短至2小时。

2. **超滤与微滤技术（Filtration）**：
- **常规UF**：适用于尿液中EV浓缩（回收率77.5%），但血浆样本易出现膜污染。
- **交叉流过滤（TFF）**：通过层流剪切力减少膜吸附，适用于工业级生产（处理量达500 mL/min）。
- **创新设计**：
- **ExoTFF系统**：结合电动力学（电场辅助过滤）与TFF，EV回收率提升至98%，纯度达85%。
- **微流控芯片**：集成200 nm与50 nm膜层，实现血浆中EV亚群（30-200 nm）高效分离，通量提升10倍。

#### （二）电荷介导技术（Charge-Based Techniques）
1. **离子交换色谱（IEX）**：
- **阴离子交换（AEX）**：利用EV负表面电荷分离，但对脂蛋白（如ApoB-100）选择性不足。
- **阳离子交换（CEX）**：适用于捕获EV中正电荷蛋白（如herpesvirus糖蛋白），但对尺寸重叠物（如病毒颗粒）无区分能力。
- **联用策略**：如AEX结合尺寸排阻，可同时去除脂蛋白（>98%）和病毒（>90%）。

2. **电动力学分离（DEP/TFF）**：
- **微流控DEP芯片**：通过非均匀电场实现EV特异性捕获（如CD63标记的EVs），回收率可达76%-92%。
- **光控DEP（ODEP）**：利用数字微镜投影光场，动态调节电场实现EV精准捕获与释放，通量达10 mL/min。

#### （三）亲和力捕获技术（Affinity-Based Techniques）
1. **免疫亲和色谱（IAC）**：
- **单克隆抗体**：如anti-CD63（灵敏度达10^9 EVs/mL），可捕获99%以上EV，但易受细胞来源影响（如血小板EV表达CD63较少）。
- **纳米抗体（VHH）**：结合更小尺寸（<10 nm）和更强结合力（Kd值低至nM级），适用于尿液中EV浓缩（回收率98%）。

2. **生物配体技术**：
- **多肽结合**：如SNGFKKHI肽对exomeres特异性结合（亲和常数~10^6 M?1），血浆中EV纯度提升至90%。
- **脂质介导**：磷脂酰丝氨酸（PS）靶向肽（如CLIKKPF）可捕获PS阳性EVs，减少30%脂质污染。

#### （四）新兴技术融合趋势
1. **多技术联用系统（Hybrid Workflows）**：
- **TFF-SEC-MMC**：血浆样本经TFF浓缩（10倍）→ SEC去脂蛋白 →MMC（多模态色谱）进一步纯化，最终EV纯度>99%。
- **微流控芯片集成**：如Exodisc系统结合200 nm（大EV）与20 nm（小EV）膜层，实现血浆中EV亚群分步捕获（时间<30分钟）。

2. **智能化与自动化**：
- **在线检测平台**：如EVics系统实时监测粒径分布（RSD<5%）和蛋白质含量（<1%），自动终止分离流程。
- **机器学习辅助优化**：通过AI算法预测不同样本的最佳分离参数组合（如血浆样本：TFF（500 kDa）→IAC（anti-CD63）→ SEC（Sephadex CL-6B））。

### 三、临床应用与产业化瓶颈
1. **诊断领域突破**：
- **液体活检**：EVs从血浆中分离后，通过纳米孔测序（检测限54 EVs/μL）实现早期癌症筛查（特异性>90%）。
- **疫苗递送系统**：工程化改造的植物EVs（如槭树胶EVs）纯度达85%，在FDA批准的I期临床试验中展现安全性与免疫原性。

2. **产业化挑战**：
- **标准化缺失**：不同厂商设备间回收率差异达40%（如磁珠法：70%-90% vs微流控：85%-95%）。
- **成本控制**：TFF模块化设备单次成本约$500，但可处理200 L血浆；传统UC单次处理成本>=$2000。
- **法规要求**：FDA已发布《外泌体药物生产工艺指南》，强调需验证EV亚群（如exomeres与supermeres）的功能一致性。

### 四、未来发展方向
1. **材料创新**：
- **仿生膜材料**：模拟细胞外基质微环境，减少EV吸附损耗（实验显示纯度提升15%）。
- **自组装纳米孔膜**：孔径可调（5-200 nm），实现EV亚群精准分离。

2. **工艺优化**：
- **连续式生产**：仿照生物制药连续灌流模式，设计可处理10 L/h血浆的模块化TFF系统。
- **低温保存技术**：添加1 M蔗糖与0.5 mM EDTA的冷冻保护液，使EV活性保存率>95%（-80℃冷冻）。

3. **智能化升级**：
- **数字孪生系统**：建立工艺参数（流速、电场强度）与EV质量（粒径、蛋白质谱）的映射模型。
- **自校准微流控芯片**：集成CMOS图像传感器实时监测膜污染，自动调整清洗频率。

### 五、技术选型建议
| 场景 | 推荐技术组合 | 优势指标 |
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| 实验室研究（小样本） | UF（100 kDa）→IAC（anti-CD63） | 纯度>95%，回收率80%-90% |
| 临床诊断（中大批量） | TFF（500 kDa）→SEC（Sephadex CL-6B） | 纯度>98%，通量>50 mL/min |
| 个性化治疗（定制化） | DEP芯片（抗EpCAM/CD81双标记） | EV亚群分型精度达85% |
| 植物来源EVs | HIC（疏水相互作用）→微流控纯化 | 纯度>90%，避免动物源污染 |

本综述系统梳理了EV分离技术的演进路径，揭示多技术联用的必要性（单一技术纯度上限约92%）。未来研究应聚焦于：
- **纳米级污染物去除**：开发基于金属有机框架（MOFs）的尺寸-电荷双模式吸附材料。
- **功能完整性验证**：建立EV功能活性（如细胞迁移抑制率、miRNA递送效率）的标准化评估体系。
- **规模化生产认证**：推动ISO 13485医疗器械认证体系在外泌体生产中的应用。

该领域的技术突破将推动外泌体在肿瘤免疫治疗（如工程化改造的间充质干细胞EVs）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病EV疫苗）等领域的应用落地。