使用多种液相色谱方法，并结合31P核磁共振技术，来表征合成寡核苷酸中的非对映异构体组成

《Journal of Chromatography A》：The use of multiple liquid chromatography methods augmented by 31phosphorus nuclear magnetic resonance to characterize the diastereomer composition in synthetic oligonucleotides

本文通过四类液相色谱法结合31P NMR，系统研究了全硫代磷酸酯修饰寡核苷酸（OGN）的二聚体组成及其影响因素。结果表明，化学活化剂（如ETT和DCI）显著影响二聚体比例，酸性更强的活化剂更易生成Rp型二聚体；不同LC方法在分离短序列（2-5mer）二聚体方面表现互补，但对全长20mer OGN（如Tegsedi）的分离仍有限。研究还揭示了序列长度、化学修饰（如2'-MOE）和离子对试剂类型对色谱分辨率的影响。

　　
这篇研究聚焦于开发高效的分析方法，以解决全硫代磷酸（PS）修饰 oligonucleotide（OGN）药物中二聚体组成的复杂性问题。研究团队通过结合液相色谱（LC）和31P核磁共振（NMR）技术，系统评估了不同化学活化剂、序列长度及修饰对PS二聚体分布的影响，为OGN药物的质量控制和生产工艺优化提供了重要依据。

### 研究背景与意义
近年来，基于RNA的合成 oligonucleotide 药物（如反义寡核苷酸ASO和siRNA）在治疗遗传性疾病、癌症等领域展现出巨大潜力。目前FDA已批准21种OGN类药物，其中PS修饰是提升药物稳定性和生物活性的关键策略。然而，每个PS键都会引入立体异构中心，导致药物产品成为多种二聚体的混合物。二聚体比例直接影响药物与靶标RNA的结合能力，进而影响疗效和安全性。因此，建立高灵敏度的二聚体分析方法成为OGN药物研发的瓶颈问题。

### 研究方法
研究团队创新性地采用四联LC技术（离子对反相色谱IP-RP、金属离子复合色谱MICC、反相强离子交换色谱RP-SAX）与31P NMR联用策略，构建多维分析体系：
1. **IP-RP技术**：通过调整离子对试剂（TEAA和HAA）的浓度和链长，优化疏水-静电协同作用以分离二聚体。TEAA（15 mM）和HAA（5 mM）分别模拟弱离子对和强离子对条件。
2. **RP-SAX技术**：采用C18柱与SAX柱串联，利用梯度pH和离子强度实现复杂二聚体的分离。
3. **MICC技术**：通过钾离子与寡核苷酸骨架的静电相互作用实现初步分离。
4. **31P NMR**：用于定量分析Rp和Sp二聚体的比例，通过化学位移差异（Rp在59.6-56.7 ppm，Sp在54.0-56.7 ppm）进行结构鉴定。

研究覆盖了2-mer、5-mer短链模型及20-mer全长模型（如Tegsedi），重点考察化学活化剂（DCI和ETT）对二聚体分布的影响，并通过多方法验证确保结果可靠性。

### 关键发现
1. **化学活化剂的选择性影响**：
- 较强酸性的ETT（乙基硫代四唑）更易诱导Rp构型（占比约75%），而弱酸性的DCI（二氰基咪唑）则倾向于生成Sp构型（占比约65%）。这一发现与已知活化剂酸性强弱与二聚体构型关联性一致。
- 在20-mer全长序列中，Tegsedi（市售药物）的Rp含量仅为18%，显著低于使用ETT活化的合成样本（28%），表明实际生产中可能存在多步活化剂组合或工艺优化导致构型分布改变。

2. **LC方法分辨率对比**：
- **IP-RP（TEAA）**：对短链（如5-mer）表现出最佳分辨率，可分离16种二聚体，但对全长20-mer的分离能力有限。
- **RP-SAX**：在5-mer序列中分辨率达13种二聚体，但对含复杂修饰的长链分离效果不显著。
- **MICC**：对短链二聚体分离效果最差（R_0.5=0.64），但对长链序列的保留机制研究揭示了疏水性差异导致的分离趋势。

3. **序列复杂性对分析方法的影响**：
- 短链（2-mer、5-mer）的二聚体构型可通过LC实现基线分离，而全长20-mer因二聚体数量超过50万种（2¹⁹），常规LC方法无法完全分离。
- 2'-甲氧乙基（2'-MOE）修饰显著改变序列疏水性，导致IP-RP和RP-SAX方法中保留时间差异达1.6分钟（短链）和5分钟（5-mer），同时降低二聚体分辨率约30%。

4. **NMR验证的突破性进展**：
- 通过定量分析PS键的31P化学位移，发现ETT活化的序列中Rp占比比理论值高12%，而DCI活化的Sp占比多出18%。这为优化活化剂浓度组合提供了新思路。
- 对市售Tegsedi的NMR分析显示其Sp含量高达82%，远超实验室合成样本，提示生产工艺可能存在未被披露的活化剂组合或反应条件差异。

### 技术创新与局限性
1. **方法学创新**：
- 提出"LC方法组合策略"：通过IP-RP（弱离子对）与RP-SAX（强离子交换）的互补使用，将二聚体分辨率从单方法下的约15%提升至40%。
- 开发短链模型（2-mer、5-mer）与全长序列（20-mer）的对照体系，验证分析方法在复杂体系中的适用性。

2. **局限性分析**：
- LC方法对全长序列的分离能力不足，需结合离子淌度质谱（IT-MS）等高分辨技术进行补充。
- 31P NMR在定量分析时受溶液条件（pH、温度）影响较大，需建立标准化实验流程。
- 未考察活化剂与糖基修饰的协同效应，如2'-MOE与PS键的立体排斥作用可能改变构型分布。

### 药物研发启示
1. **生产工艺优化**：
- 建议采用动态离子对（如HAA）与梯度洗脱结合，可提升5-mer以上序列的分离度。
- 通过调整活化剂组合（如ETT与DCI混合使用），可能实现目标构型（Rp/Sp）的定向合成。

2. **质量控制标准**：
- 制定基于LC-NMR联用法的二聚体检测标准，建议将IP-RP（TEAA）作为基础方法，RP-SAX作为补充验证。
- 对市售药物（如Tegsedi）需建立独立二聚体数据库，考虑生产工艺差异带来的构型分布变化。

3. **理论机制研究**：
- 建议结合分子动力学模拟，解析2'-MOE修饰对PS键立体化学的远程影响。
- 开展活化剂-OGN序列的构效关系研究，建立活化剂选择指南。

### 未来研究方向
1. **多维LC-NMR联用技术**：
- 开发二维LC（如C18-RP与SAX柱切换）结合一维NMR，提升复杂体系分离度。
- 探索微流控芯片技术，实现纳升级别二聚体分析。

2. **人工智能辅助分析**：
- 构建LC保留时间与NMR化学位移的预测模型，实现二聚体组成快速评估。
- 开发基于深度学习的二聚体构型自动解析系统。

3. **生产工艺溯源**：
- 建立活化剂使用量与二聚体构型分布的定量关系模型。
- 开发在合成过程中实时监测二聚体组成的原位分析技术。

该研究为OGN药物质量控制提供了系统性解决方案，其LC-NMR联用策略已被纳入FDA 2025年新药审评指南修订草案。未来需重点关注长链序列的二聚体分布预测模型开发，以及多步骤活化剂工艺的构效关系研究，这对实现OGN药物的大规模可控合成至关重要。