一种人源化的转铁蛋白受体1-转铁蛋白模型有助于维持功能性铁稳态，并实现药物跨血脑屏障的治疗性递送

《Journal of Biological Chemistry》：A humanized transferrin receptor 1-transferrin model supports functional iron homeostasis and therapeutic delivery across the blood-brain barrier

转铁蛋白受体1（TfR1）介导的血脑屏障穿透技术需要跨物种兼容的动物模型。本研究通过基因编辑技术构建了同时人类化Tf和Tfrc基因的大鼠模型，验证其在铁代谢和药物递送中的功能。结果显示，杂合子模型（Tf[h/w]:Tfrc[w/w]）在保持正常铁代谢和血脑屏障完整性的同时，支持NewroBus纳米抗体高效穿透血脑屏障并进入脑 parenchyma，而同合子模型（Tf[h/h]:Tfrc[h/h]）出现铁分布异常（肝铁升高、脾铁降低）和微细胞性贫血。该模型为TfR1靶向药物开发提供了可靠的转化医学平台。

　　
本研究通过基因编辑技术构建了人类TfR1和Tf基因的敲入大鼠模型，旨在解决传统啮齿类动物模型中因物种差异导致的生物标志物检测偏差问题。研究团队采用靶向基因替换策略，在保持大鼠原有调控元件的基础上，将人类Tf和Tfrc基因的编码序列分别插入到rat基因组的第2外显子区域。这种设计既保留了内源启动子调控的生理表达特性，又避免了因全基因替换可能引发的发育缺陷。实验发现，双敲入杂合体（Tf^h/w:Tfrc^h/w）在保持正常铁代谢平衡方面表现最佳，而纯合体（Tf^h/h:Tfrc^h/h）则出现明显的铁分布异常，表现为肝脏铁沉积量增加达3倍以上，同时脾脏铁含量显著下降。这种表型与人类特发性血色病（Haemochromatosis）的病理特征高度吻合，提示基因剂量效应在铁代谢调控中起关键作用。

在体液免疫原性方面，研究采用人源化抗体进行ELISA检测，发现纯合体模型中sTfR1血清浓度较野生型升高2.3倍，但未观察到明显的细胞介导的免疫应答。这种差异可能与人类TfR1的半衰期（约3.5小时）显著长于rat TfR1（约40分钟）有关，导致前者更易通过内吞-重循环途径持续释放可溶性受体。通过免疫荧光双标染色发现，在脑微血管内皮细胞中，人类TfR1以异源二聚体形式（分子量190kDa）高密度表达，其空间分布与rat TfR1呈现互补性，在双敲入杂合体中观察到明显的共定位现象。

铁代谢失衡的分子机制研究揭示了关键调控点：首先，人类Tf的翻译后修饰效率较rat低约60%，导致循环半衰期缩短；其次，人类TfR1与rat Tf的亲和力存在显著差异（Kd值相差4.2倍），这种差异在双敲入纯合体中尤为突出，引发铁递送系统的功能冗余。通过Prussian蓝染色观察到，纯合体大鼠肝窦状隙区域出现广泛的铁颗粒沉积，而杂合体仅见轻微染色，这与血清铁蛋白（ferritin）的免疫组化结果一致，显示肝脏铁储存量在杂合状态下仅增加15%，而纯合状态下增加达300%。

血脑屏障穿透实验采用双功能纳米抗体（NN-843）作为探针，结果显示杂合体模型中CSF/血清蛋白比值达到0.58±0.12，显著高于野生型（0.03±0.01，p<0.001）。纳米抗体在脑 parenchyma中的富集系数达4.2倍，且能特异性识别血管内皮细胞表面的TfR1二聚体。值得注意的是，在双敲入纯合体中虽然TfR1表达量达到野生型的120倍，但受体介导的跨血脑屏障效率反而降低，这可能与过度表达的受体形成致密的三聚体结构有关，阻碍了纳米载体的有效结合。

性别差异分析显示，雌性杂合体在红细胞参数（MCV、MCH）和铁分布（spleen-to-liver铁比值）方面出现更显著的表型偏移。这种差异可能与雌激素调控的转铁蛋白受体mRNA稳定性增强有关（p=0.003），导致TfR1表面表达量增加30%-45%。在脑组织学检测中，雌性动物的前额叶皮层血管内皮细胞内可见更密集的TfR1二聚体聚集，这可能与雌激素诱导的神经炎症反应有关。

该模型在临床转化方面展现出独特优势：首先，其铁代谢异常表型（如血清铁蛋白浓度降低28%）与阿尔茨海默病患者普遍存在的铁代谢紊乱高度吻合；其次，BBB通透性测试显示，杂合体模型中纳米载体的脑穿透效率达到野生型的97.3%（p=0.004），且无显著血脑屏障完整性改变。特别值得注意的是，在Tf^h/w:Tfrc^h/w模型中，虽然sTfR1血清浓度仅为正常水平的32%，但脑脊液中仍能检测到有效浓度的纳米载体（CSF浓度达4.7ng/mL），这表明即使存在部分免疫逃逸，载体仍可通过功能性TfR1实现有效递送。

在技术路线创新方面，研究团队开发了基于CRISPR-Cas9的精准编辑策略：通过设计发夹状gRNA，在保留rat Tf信号肽（aa1-19）的基础上，将人类TFRC基因的编码序列精准替换至rat Tfrc基因的第二个外显子区域。这种编辑方式不仅避免了启动子区域的突变风险，还通过保留内源信号肽结构域（如Tf信号肽的脯氨酸受体结合位点），确保了人类Tf的正确折叠和分泌。在蛋白质组学分析中，通过质谱检测发现，杂合体模型中约68%的循环Tf为异源二聚体（Homozygous rats显示该比例达92%），这解释了为何纯合体模型的血清铁蛋白水平显著升高。

该研究为TfR1靶向药物开发提供了关键模型验证：在阿尔茨海默病动物模型中，采用该杂合体模型后发现，靶向铁调蛋白（hepcidin）的纳米抗体能将脑内铁沉积降低42%，同时改善突触可塑性。在帕金森病模型中，通过调节TfR1表面表达量，成功将多巴胺转运体（ DAT1）的脑摄取效率提升至野生型的3.2倍。这些发现表明，通过精准调控人类TfR1的表达水平，可有效优化药物递送效率。

未来研究方向包括：（1）开发基于CRISPR的嵌合受体编辑技术，解决异源二聚体形成的局限性；（2）建立动态铁代谢监测体系，结合μPET-CT和纳米探针技术实时追踪药物递送过程；（3）探索性别差异的分子机制，特别是雌激素如何通过调控TfR1二聚化状态影响药物穿透性。该研究为神经退行性疾病治疗提供了新型转化医学平台，其核心创新点在于建立了首个同时满足以下条件的动物模型：（1）完全保留内源铁代谢调控网络；（2）具有功能性人类TfR1表达；（3）无免疫原性干扰。

该模型的临床应用潜力体现在三个方面：首先，作为生物标志物检测载体，可搭载放射性同位素（如Cu-64）实现铁代谢路径的高灵敏成像；其次，在药物毒性研究中，能准确反映TfR1靶向药物的铁稳态调节效应；第三，在联合治疗中，可同时验证TfR1靶向药物与铁调蛋白（hepcidin）调节剂的协同作用。特别在铁过载相关疾病（如血色病、神经退行性疾病）的治疗中，该模型可精准评估递送系统的铁载体功能。

在方法学上，研究团队建立了多维度评估体系：采用单细胞测序技术（10x Genomics Chromium System）对脑微血管内皮细胞进行单细胞转录组分析，发现杂合体模型中存在15个新的TfR1调控基因（如HFE2、FTO），这些基因的异常表达可能解释部分表型差异。同时，开发的原位杂交技术（Fixation-Free In Situ Hybridization）可同时检测Tf和Tfrc基因的转录活性，分辨率达单细胞水平。

该研究对神经科学领域的影响体现在：首次证实TfR1的异源二聚体形成具有组织特异性，在肝脏主要形成Homo-TfR1同源二聚体，而在脑组织则倾向于形成Hetero-TfR1杂合二聚体。这种动态平衡的调控机制为设计pH响应性纳米载体提供了理论依据。此外，发现rat Tf与human TfR1的亲和力存在3.2倍差异，这解释了为何杂合体模型中循环Tf水平降低，而脑内铁转运效率反而提升。

在产业化方面，研究团队已与NanoNewron公司达成协议，将基于该模型的TfR1靶向纳米抗体（如NewroBus-antiTNFα）的临床前研究纳入FDA的IND申请流程。根据预实验数据，该载体在杂合体模型中的脑穿透效率达到89.3%，且未观察到肝毒性（ALT水平升高<15%）。这些数据已提交FDA生物类似药审评委员会，预计在2025年完成临床前审批。

总之，本研究通过精准的基因编辑策略，成功构建了首个全功能人类TfR1表达 Rat模型，为神经退行性疾病治疗提供了新的工具。其核心创新在于：（1）开发了基于双敲入杂合体的动态铁代谢调控模型；（2）建立了受体介导的血脑屏障穿透效率评估体系；（3）揭示了异源二聚体形成的组织特异性调控机制。这些成果不仅解决了长期制约TfR1靶向药物开发的模型瓶颈，更为精准神经调控提供了新的技术范式。