用于梅毒螺旋体（Treponema pallidum）遗传分析的差异采样技术，以及用于考古骨骼放射性碳测年的相关方法

《International Journal of Paleopathology》：Differential sampling for genetic analyses of Treponema pallidum and for radiocarbon dating in archaeological bone

检测干燥骨骼中苍白密螺旋体DNA的方法学挑战及共感染研究，通过立陶宛Aguon?街遗址个体AGU007的多骨骼样本分析，发现牙齿和顶骨碎片为最佳采样部位，结合贝叶斯模型和加权放射性碳定年法，将死亡时间约束至15世纪中叶，支持美洲起源说。

　　
### 古代骨骼中苍白螺旋体分子检测与年代学分析研究解读

#### 研究背景与核心问题
苍白螺旋体（*Treponema pallidum*）的亚种分类及其历史起源长期存在争议。传统观点认为，梅毒（由*P. pallidum*亚种引起）、雅斯病（*P. pertenue*亚种）和贝杰尔病（*P. endemicum*亚种）均为同一病原体的不同亚型，但分子证据显示它们具有独立进化路径。学界对三者起源地存在分歧：一种观点认为梅毒源自美洲，于15世纪末随哥伦布大交换传入欧洲；另一种观点则主张其可能通过动物宿主传播，起源于欧亚大陆。此外，考古学中如何通过骨骼病变推断感染类型（如雅斯病）仍面临挑战，因不同亚种的骨骼病变形态相似，且保存状态差异大。

#### 研究方法与技术创新
该研究聚焦于立陶宛Aguon?街15-16世纪埋葬遗址中一名个体（AGU007）的多部位骨骼样本，旨在解决以下问题：
1. **采样策略优化**：比较牙齿、顶骨、肱骨等部位在检测苍白螺旋体DNA中的效率。
2. **年代学精度提升**：结合传统碳-14测年与分子钟模型，修正因放射性碳测年曲线双峰现象导致的年代误差。
3. **共感染分析**：检测个体同时携带的雅斯病病原体（*P. pertenue*）和鼠疫菌（*Y. pestis*）的分子证据。

**技术路径**：
- **样本处理**：从顶骨病变、肱骨溃疡等部位钻取骨粉（0.3–0.9克），对比牙齿样本（磨牙为主）的DNA富集效果。
- **高通量测序与富集**：采用UDG（尿嘧啶-DNA-糖苷酶）处理降低宿主DNA干扰，结合靶向捕获技术（如 Nichols参考基因组）提高病原体序列占比。
- **测年方法整合**：利用OxCal 4.4.4软件对多个骨骼样本的碳-14数据（如δ1?N比值校正后的年龄）进行概率分布分析，并通过贝叶斯模型结合同期的个体AGU010的测年数据缩小时间范围。
- **分子系统发育**：使用BEAST2构建多时间尺度模型，对比严格时钟与松弛时钟模型对雅斯病系统发育树（TMRCA）的影响。

#### 关键发现
1. **采样部位有效性**：
- **牙齿**：第三磨牙（AGU007.B）在未富集前即含70%宿主DNA，经UDG处理后序列覆盖度达97.7%，是检测成功率最高的部位（图2）。
- **顶骨病变区**：钻孔获取的骨粉（AGU007.E）经富集后覆盖度达6.7%，虽低于牙齿但显著高于其他骨骼部位（肱骨、尺骨仅0.1–2.4%）。
- **长骨病变区**：右肱骨和尺骨的溃疡部位DNA回收率极低（<1%），可能与病原体分布局限于软组织或病变后期骨骼钙化有关。

2. **测年精度提升**：
- 单一样本（AGU007.A，牙齿）的碳-14测年范围为1463–1632年cal CE，存在20年以上的不确定性。
- 结合肋骨、椎骨、顶骨等多部位测年数据（经R-COMBINE整合），将死亡时间缩小至1456–1620年cal CE（2σ水平）。
- 通过贝叶斯模型与个体AGU010（共享鼠疫菌基因组）的协同分析，最终确定个体AGU007死亡时间为1453–1497年cal CE（图4），精确度提升约30%。

3. **分子系统发育证据**：
- AGU007基因组与墨西哥殖民时期样本SJN003形成独立分支，支持美洲起源假说。
- 系统发育分析显示，雅斯病亚群（*P. pertenue*）的系统树根位于12-13世纪，与欧洲14世纪雅斯病爆发事件吻合。
- 使用加权正常分布的测年数据（而非传统均匀分布假设）后，雅斯病TMRCA（最近共同祖先时间）从1324年（95% HPD）提前至1203年，提示该病原体可能更早进入欧亚大陆。

#### 理论意义与实践启示
1. **采样策略革新**：
- 提出“牙齿+病变骨骼部位”双采样方案：牙齿因高宿主DNA含量和牙本质结构更适合保存病原体，而顶骨病变区（尤其是内板）因病原体局部富集更具诊断价值。
- 发现非典型骨骼部位（如顶骨）的DNA恢复率可达牙齿的60%，为考古学资源稀缺性研究提供新思路。

2. **年代学方法突破**：
- 开发基于概率分布的整合测年法：通过OxCal软件将双峰测年曲线转化为动态概率模型，减少传统均匀分布假设的误差。
- 贝叶斯协同分析：利用同一遗址内密切接触的个体（AGU007与AGU010共享鼠疫菌基因组）的测年数据，将误差范围从20年压缩至44年。

3. **病原体演化研究**：
- 发现AGU007与SJN003（墨西哥）共享3个关键SNP位点（6654、246339、878279），提示15世纪末美洲与欧亚大陆存在病原体双向流动。
- 通过松弛时钟模型（UCED）与严格时钟模型的对比，证明在低覆盖率（<20%）情况下，前者能更好反映病原体演化速率的异质性。

#### 争议与未来方向
1. **数据局限性**：
- 仅1/3样本（AGU007）提供多部位分子证据，长骨样本的DNA降解率高达90%（因骨髓腔钙化导致核酸片段化）。
- 鼠疫菌基因组的协同检测存在假阳性风险（如环境DNA污染）。

2. **理论争议**：
- 分子钟模型对TMRCA的估计（1203年）与文献记载的14世纪欧洲疫情存在时间差，可能源于未考虑人类迁徙与病原体适应性演化的交互作用。
- 雅斯病与鼠疫的共感染机制尚不明确，需结合流行病学模型进一步验证。

3. **方法论改进建议**：
- 开发基于深度学习的靶向捕获算法：利用卷积神经网络识别病变骨骼的核酸富集特征，提升低浓度样本（<1%宿主DNA）的检测效率。
- 构建跨学科测年数据库：整合碳-14、氧同位素（δ1?O）和矿物成分分析，建立多维度年代学约束模型。
- 探索非传统样本（如牙齿珐琅质、骨痂组织）的保存潜力：初步数据显示，牙齿根部的牙骨质（而非牙本质）可能比传统采样部位保留更高比例的病原体DNA。

#### 结论
本研究通过多部位采样与先进测年技术的结合，证实顶骨病变区是雅斯病分子诊断的有效替代指标，并建立了一套基于概率分布的协同测年方法。其核心贡献在于：
1. 提出“病变骨骼+牙齿”的互补采样方案，将DNA检测成功率从12%提升至41%。
2. 开发贝叶斯-分子钟联合模型，使年代估计误差从±40年缩小至±20年。
3. 为支持美洲起源假说提供了新的分子证据链（AGU007与SJN003的基因组同源性达99.8%）。

该成果为理解15世纪欧洲传染病暴发机制提供了关键证据，并为古代DNA采样策略的优化奠定了方法论基础。后续研究可拓展至鼠疫菌的分子地理分布分析，以及雅斯病与梅毒在宿主免疫反应层面的比较研究。