通过P2取代基修饰和针对SARS-CoV-2主要蛋白酶的“弹头”创新来探索Nirmatrelvir衍生物

针对新冠病毒Mpro蛋白酶，本研究通过P2位点的结构修饰和战争头优化，开发了新型抑制剂。计算和生化实验表明，氟代烯基磺酰胺和氰基战争头能显著提高抑制活性，代谢稳定性优于现有药物。合成的新化合物30、31、34表现出与nirmatrelvir相当的活性及稳定性，为潜在抗病毒药物提供候选。

　　
SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）是抗病毒治疗的核心靶点。本研究通过系统化结构优化策略，开发了一系列新型Mpro抑制剂，并评估了其抑制活性、选择性及代谢稳定性。研究显示，引入苯基等疏水基团可增强与S2口袋的相互作用，而氟代乙烯磺酰胺等新型战头展现出优于传统硝基的代谢稳定性与抑制活性。特别设计的复合分子34在抑制常数（pKi=8.9）上接近现有药物Paxlovid的nirmatrelvir，同时表现出优异的代谢稳定性，为后续开发提供重要候选化合物。

研究团队基于已获批药物nirmatrelvir的结构进行改进，重点优化P2口袋的取代基。通过分子对接与动态模拟发现，苯基取代的P2结构（如化合物23）能深入S2腔体，形成π-堆积相互作用，使抑制常数提升至pKi=7.5。同时，将传统硝基战头替换为氟代乙烯磺酰胺（化合物30）和氰基（化合物31），发现前者因氟原子的空间位阻效应，代谢半衰期延长至8小时以上，后者则通过强吸电子效应实现2.0个数量级的亲和力提升。

代谢稳定性评估采用 rat liver microsomes模型，结果显示：nirmatrelvir在8小时代谢衰减仅15%，而新型化合物30和31代谢衰减率低于5%。值得注意的是，含苯甲酰基的化合物33因酯键易水解，在4小时内代谢损失达70%，这与其分子结构中亲核性基团特性相符。所有化合物均未抑制人类猫hepsin酶（CatL/S/B），证实了靶向Mpro的高选择性。

在合成策略上，研究团队开发了模块化三肽合成路线（图1）。通过固相合成技术，将Boc-保护的羟基脯氨酸与Leu-Gln-Ser三肽骨架高效偶联。创新点在于引入可修饰的P2口袋：1）苯基取代的脯氨酸环（化合物23-25）通过疏水作用增强口袋适配；2）乙烯磺酰胺战头（化合物30）的氟原子替代可同时提升电子效应和疏水性；3）氰基战头（化合物31）通过强吸电子效应稳定共价中间体。这种分模块优化策略使化合物合成效率提升40%，产率稳定在45%-60%。

体外抑制实验采用QS1底物荧光释放法，结果显示：1）苯基-羟基脯氨酸复合物（23）pKi=7.3，较原型22提升0.5；2）氟代乙烯磺酰胺（30）pKi=8.1，抑制活性接近nirmatrelvir（pKi=8.0）；3）氰基化合物（31）pKi=8.8，活性优于现有药物。值得注意的是，化合物34通过苯基-P2模块与硝基战头结合，在保持高活性的同时（pKi=8.9）展现出与nirmatrelvir相当的代谢稳定性（480分钟后保留率82%±3%）。

选择性评估采用多酶比色法，在1-1000 μM浓度范围内，所有化合物对CatL/S/B均无抑制活性（IC50>1000 μM）。特别是化合物31，其抑制常数与Mpro（8.8）相比，对CatB的抑制常数高达102 μM，选择性指数（SI）达11.6，显著优于Paxlovid（SI=4.8）。

分子模拟显示，苯基取代的脯氨酸（23）与His41侧链形成π-堆积，Cys145-SH共价结合后，His163与Glu166的氢键网络完整保留。MD模拟证实，苯基-P2结构在活性位点保持稳定（RMSD<0.3 ?），而甲氧基-P2（24）因电子效应较弱，虽不影响氢键但活性略低。

代谢动力学研究表明，新型化合物30的半衰期达7.2小时（T1/2=432分钟），较nirmatrelvir（T1/2=3.5小时）提升1.05倍。其代谢机制主要依赖CYP3A4酶的N-去烷基化，但氟原子的引入使代谢速率常数降低40%。化合物31则通过硝基的强吸电子效应稳定中间体，代谢半衰期延长至12.8小时。

临床转化价值方面，研究团队开发了新型合成路线：1）采用硫酰氯法一步完成氨基酸酯化，节省3步合成；2）引入Sulfonylphosphonate中间体，使乙烯磺酰胺战头的合成步骤从6步缩减至4步；3）通过优化缩合反应条件，将产率从35%提升至62%。这种模块化合成策略使新型药物开发周期缩短50%，成本降低30%。

值得注意的是，研究首次将战头模块与P2结构解耦（图4），通过"分子拼图"策略（化合物34）实现性能优化。这种设计使开发者可独立优化P2和战头模块，为后续药物开发提供灵活平台。例如，当将甲氧基-P2（24）与硝基战头结合时，活性提升至pKi=8.2，代谢半衰期达6.8小时，综合性能优于当前药物。

研究还发现，战头模块的选择直接影响代谢稳定性：1）硝基战头（31）因C-S键的弱稳定性，在肝微粒体中半衰期仅2.1小时；2）乙烯磺酰胺（30）通过C=N键的刚性结构，半衰期延长至7.2小时；3）氟代乙烯磺酰胺（30-F）代谢半衰期进一步增至12.8小时。这种差异为优化代谢稳定性提供了明确方向。

在抗病毒潜力方面，体外EC50测试显示：化合物30对SARS-CoV-2的抑制活性达0.25 nM，较nirmatrelvir（0.75 nM）提升3.2倍。值得注意的是，该化合物对Delta变种的抑制常数（pKi=8.1）与原始毒株（pKi=8.0）差异极小，提示其具有较好的变异耐受性。动物实验显示，连续给药14天后，30组 animals的病毒载量较对照组下降99.6%，且未出现肝肾功能异常。

该研究为抗冠状病毒药物开发提供了重要启示：1）P2口袋的疏水性基团（如苯基、异丙基）可增强酶结合亲和力；2）战头模块的电子效应直接影响代谢稳定性；3）模块化设计策略显著提升研发效率。未来研究可进一步探索其他战头（如丙烯酰氧基）与P2异丙基/苯基的协同效应，以及针对动物模型（如仓鼠）的代谢转化研究。