在Physcomitrella（小立碗菜）中利用CRISPR/Cas9进行靶向基因筛选，发现了新的细胞分裂相关基因

《Frontiers in Plant Science》：CRISPR/Cas9 targeted genetic screening in Physcomitrella identifies novel cell division genes

细胞分裂相关基因的发现及进化分析：利用CRISPR/Cas9和共表达分析在苔藓植物Physcomitrium patens中鉴定出三个新基因家族（CYR、LACH、SpinMi），分别与胞质分裂、染色体分离和纺锤体/细胞板调控相关。这些基因家族在陆生植物中保守但无藻类同源，提示登陆过程中细胞分裂机制的适应性进化。

　　
该研究以模式植物Physcomitrium patens（地钱）为对象，系统解析了植物细胞分裂特异性基因家族的进化起源与分子功能。通过整合共表达分析与CRISPR/Cas9靶向筛选技术，研究者鉴定了三个首次在植物中描述的基因家族，为理解陆生植物登陆适应提供了分子证据。

一、研究背景与核心假设
植物细胞分裂在多个层面区别于动物和真菌系统。其核心特征包括：1）依赖phragmoplast而非中心体构建纺锤体；2）通过细胞板完成胞质分裂；3）存在独特的PPB（前极体带）形成机制。这些特征暗示植物在登陆过程中经历了显著分子机制的适应性演化。已有研究在植物中鉴定出KNOLLE、FASS/TON2等特定基因，但多数研究仍停留在模式生物（如拟南芥）的层面，缺乏对早期陆生植物（如苔藓）系统基因组的解析。

核心研究假设为：通过共表达网络筛选候选基因，结合CRISPR/Cas9靶向编辑，可在苔藓植物中发现新的细胞分裂相关基因家族，并揭示其登陆适应性进化特征。

二、创新性研究方法
1. **多维度基因筛选体系**：
- 基于JGI Plant Gene Atlas数据库的25个已知分裂相关基因（含微管蛋白、激酶等），构建共表达网络
- 采用0.8的共表达阈值过滤，排除已注释功能基因
- 筛选出216个候选基因（含52个拟南芥同源基因）

2. **CRISPR/Cas9靶向编辑策略**：
- 设计单gRNA靶向多基因家族的保守位点
- 通过 frameshift 突变体筛选（保留率>5%）
- 结合荧光定位验证（mCherry标记微管，mNeonGreen标记候选蛋白）

3. **表型分析体系**：
- 建立微流控芯片进行高密度单细胞分析（1000+细胞/样本）
- 开发活细胞成像系统（时间分辨率2分钟，空间分辨率5μm）
- 引入药理学干预（20μM oryzalin微管解聚剂）

三、关键发现与分子机制解析
1. **CYR基因家族（胞质分裂相关）**：
- 发现两个同源基因（CYR1和CYR2）
- 突变体表现为：胞质分裂失败（32-47%异常细胞）、纺锤体宽度增加（16-12μm vs 8.28μm）、phragmoplast缩短（8-11μm）
- 荧光定位显示：纺锤体中期特异性定位，微管依赖性
- 救济实验表明CYR1具有部分功能冗余（重组体恢复80%正常表型）

2. **LACH基因家族（染色体分离调控）**：
- 发现苔藓特异性基因（Pp3c25_4280）
- RNAi干扰导致染色体分离异常（ detachment rate 14-18%）
- 荧光定位显示：中期染色体区域富集
- 表型可被外源表达的同源蛋白部分挽救

3. **SpinMi基因家族（微管组织调控）**：
- 基因体首次鉴定单拷贝基因（Pp6c14_9440）
- 突变体呈现纺锤体延长（17-16μm vs 13.74μm）
- 荧光定位显示：微管网络动态定位（前期 cytoplasmic分布，中期纺锤体中带区富集）
- 微管解聚剂处理下定位消失，证实微管依赖性

四、进化生物学启示
1. **登陆适应性基因的演化路径**：
- 三基因家族在苔藓（共26个物种）、蕨类（如Diphasiastrum complanatum）和裸子植物（Picea abies）中均存在，但缺乏藻类同源物
- 系统发育分析显示：所有同源基因在陆生植物（Archeplastida）中形成单系群（置信度>95%）
- 遗传距离计算显示：与苔藓最近祖先的分化时间约为6.8亿年前（依据化石记录推算）

2. **基因功能演化模式**：
- CYR家族（GPI锚定蛋白）与动物分泌膜蛋白存在结构相似性（同源性57%）
- LACH家族与拟南芥NODAL（节表达子）同源，但功能未完全保守
- SpinMi家族与动物MCAK（微管相关蛋白）具有相似定位模式

五、技术方法突破
1. **CRISPR筛选优化**：
- 采用多gRNA整合技术（单载体靶向3-5个基因）
- 开发适配体增强型sgRNA设计（脱靶率降低至0.5%以下）
- 建立突变体库（已收录47个功能验证样本）

2. **荧光定位创新**：
- 开发双荧光标记系统（mCherry微管+NeonGreen目标蛋白）
- 实现活细胞动态追踪（时间分辨率达2分钟）
- 创建三维重建数据库（已积累2000+细胞周期影像）

3. **进化分析体系**：
- 构建包含8个藻类和26个陆生植物的全基因组比较框架
- 采用最大似然法（ML）结合移码校准（ModelTest-NG）
- 开发置信度分级系统（BS>90%为强支持，BS>70%为中等支持）

六、生物学意义与未来方向
1. **细胞分裂机制进化**：
- 揭示陆生植物特有的phragmoplast调控网络（至少包含3个独立通路）
- 发现染色体分离的新调控层（LACH家族可能参与共价连接）
- 证实微管组织需特定因子（SpinMi家族）维持动态平衡

2. **技术应用前景**：
- 开发CRISPR筛选平台（已处理216个候选基因）
- 建立表型-基因对应数据库（覆盖32种细胞分裂事件）
- 优化基因编辑效率（单细胞编辑成功率>85%）

3. **后续研究方向**：
- 建立基因家族进化树（含7个关键节点）
- 解析CYR蛋白的GPI锚定机制（已申请冷冻电镜时间）
- 探索LACH与共价连接复合体的相互作用（计划2025年开展）

该研究通过多组学整合和先进基因编辑技术，不仅填补了苔藓植物细胞分裂机制的研究空白，更为理解植物登陆适应性进化提供了关键分子证据。其建立的方法学体系（共表达-CRISPR-荧光定位三联技术）已被纳入国际植物基因组计划（IPGP）技术标准，为后续研究提供了重要工具参考。