NOTCH2作为胆管癌预后标志物及治疗靶点的发现与机制研究

《Hormones & Cancer》：Identification of NOTCH2 as a prognostic marker for cholangiocarcinoma

本研究针对胆管癌(CCA)预后差、治疗靶点匮乏的临床难题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术解析肿瘤微环境(TME)异质性，发现JAG1-NOTCH2信号轴在CCA中异常激活。实验证实NOTCH2高表达促进肿瘤增殖且与不良预后显著相关，并通过药物敏感性筛选发现mTOR抑制剂对NOTCH2高表达患者潜在有效，为CCA精准治疗提供新策略。

　　

胆管癌是一种起源于胆管上皮的恶性肿瘤，虽然仅占胃肠道癌症的3%-5%，但其诊断困难、侵袭性强，患者预后极差。由于缺乏早期特异性症状，多数患者确诊时已处于晚期，手术切除机会渺茫。更棘手的是，胆管癌具有高度的异质性，不同患者的肿瘤微环境存在显著差异，这导致传统化疗效果有限，靶向治疗药物匮乏。目前，仅针对成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的分子疗法对部分特定患者展现希望，绝大多数患者仍缺乏有效治疗手段。因此，深入揭示胆管癌发生发展的分子机制，寻找新的预后标志物和治疗靶点，成为当前临床和基础研究亟待突破的关键问题。

以往研究多聚焦于肿瘤细胞本身，但随着对肿瘤认识的深入，科学家们发现肿瘤微环境在癌症进展中扮演着至关重要的角色。胆管癌的肿瘤微环境是一个复杂的生态系统，包含癌相关成纤维细胞(CAFs)、上皮细胞、免疫细胞等多种细胞类型。这些细胞之间通过复杂的信号网络相互作用，共同营造了一个支持肿瘤生长、侵袭、转移甚至抵抗治疗的环境。然而，由于传统测序技术只能获得细胞群体的平均基因表达信息，无法精确解析肿瘤微环境中不同细胞亚群的独特功能和它们之间的相互作用机制，极大地限制了对胆管癌生物学行为的深入理解。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的出现，为在单细胞分辨率下揭示肿瘤异质性和细胞间通讯提供了强大工具。该技术能够无偏倚地揭示组织中每个细胞的基因表达谱，从而精确识别新的细胞亚群、解析细胞状态转变轨迹以及细胞间信号网络。已有研究利用该技术对胆管癌进行分析，揭示了癌症干细胞样细胞、特殊的免疫细胞亚群等 previously unrecognized 的细胞类型，但驱动胆管癌进展的关键细胞内信号通路仍不完全清楚。

为了深入探究胆管癌的发病机制，来自青岛大学附属医院胰腺外科的胡晓教授团队在《Hormones》上发表了最新研究成果。研究人员开展了一项整合生物信息学分析、生存分析、免疫组织化学和药物敏感性筛选的系统性研究。他们利用公共数据库的单细胞RNA测序数据（来自6例肝内胆管癌(iCCA)患者及其配对的健康组织），结合癌症基因组图谱(TCGA)的胆管癌队列和本地的18例患者样本，旨在解码胆管癌与健康组织之间细胞群体的动态变化，识别关键的致病信号通路，并评估其预后价值和治疗意义。

本研究采用了几项关键技术方法：首先，利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据分析胆管癌与配对健康胆管组织的细胞组成和异质性；其次，通过生物信息学方法进行差异基因表达、通路富集和细胞间通讯分析；第三，利用TCGA数据库进行NOTCH2表达与患者总生存期的Kaplan-Meier分析；第四，通过免疫组织化学(IHC)在本地患者队列中验证NOTCH2的蛋白表达水平；第五，在HUCCT1和RBE两种胆管癌细胞系中，通过小干扰RNA(siRNA)敲低NOTCH2，并利用qRT-PCR、集落形成实验和CCK-8实验评估其对细胞增殖和活力的影响；最后，基于CellMiner数据库分析NOTCH2表达与药物敏感性的相关性。

scRNA-seq解析胆管癌的细胞异质性

为了评估胆管癌的细胞异质性，研究人员对来自6例患者的配对胆管癌和邻近胆管(BD)样本进行了scRNA-seq分析。共分析了27,257个细胞（14,280个CCA细胞和12,977个BD细胞）。细胞聚类分析识别出B细胞、癌相关成纤维细胞(CAFs)、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、上皮细胞、肥大细胞、调节性T细胞(Tregs)等多种细胞类型。通过经典标志物表达对细胞类型进行注释后发现，与健康胆管组织相比，胆管癌样本中成纤维细胞、上皮细胞、Treg细胞和B细胞的百分比更高，而NK细胞的百分比更低。特别值得注意的是，上皮细胞在胆管癌中的比例显著高于胆管组织，提示了上皮细胞在肿瘤微环境中的重要性，并支持胆管癌可能起源于上皮细胞的观点。

内皮细胞与成纤维细胞的相互作用促进胆管癌进展

肿瘤微环境中的细胞间通讯是肿瘤进展的驱动力。基因表达热图显示了每个细胞簇中差异上调最显著的基因。基于受体-配体相互作用的细胞通讯网络分析揭示了上皮细胞(EPC)和癌相关成纤维细胞(CAF)之间存在显著的相互作用，而EPC和髓系(MYE)细胞在免疫细胞网络中也非常活跃。通路分析表明，胆管癌与胆管组织之间的差异表达基因富集于TNF相关通路。进一步分析发现，EPC与CAF之间的相互作用主要由JAG1-NOTCH2和JAG1-NOTCH3信号介导。NOTCH2在MYE、EPC和CAF中高表达，而JAG1在EPC和CAF中表达最高。

肿瘤细胞中Notch通路失调

为了确定哪些细胞是肿瘤细胞，研究人员进行了等位基因特异性拷贝数变异(CNV)分析，结果将EPC细胞鉴定为肿瘤细胞。随后，他们深入研究了EPC中JAG1/NOTCH2信号在胆管癌发生中的作用。分析发现，与健康对照组相比，胆管癌组织中的JAG1和NOTCH2活性评分均显著更高。基因集富集分析(GSEA)结果显示，JAG1/NOTCH2信号在胆管癌中被激活，NOTCH信号通路评分在肿瘤组织中也显著高于对照组。对NOTCH信号下游靶标HES1、HES5和HEY2的分析显示，HES1在肿瘤中表达更高，而HES5和HEY2未检测到显著差异。

NOTCH2高表达预示胆管癌不良预后

为了评估NOTCH2的临床意义，研究人员利用TCGA胆管癌(CHOL)数据进行了Kaplan-Meier总生存分析。将患者按NOTCH2 mRNA表达水平分为高表达组（前25%）、低表达组（后25%），并排除中间表达组（25%-75%）后，结果显示NOTCH2高表达组患者的总生存期显著更短，预后更差。此外，研究团队还在本地的18例胆管癌患者组织中检测了NOTCH2的表达水平。根据治疗结果将患者分为“预后良好组”（生存期超过24个月）和“预后不良组”（24个月内复发）。免疫组织化学染色结果清晰显示，预后不良组患者的癌组织中NOTCH2蛋白表达水平显著高于预后良好组。这些发现共同表明，较高的NOTCH2表达可能作为评估胆管癌严重程度、预后判断和治疗效果的有效标志物。

NOTCH2促进肿瘤细胞增殖

为了在功能层面验证NOTCH2的作用，研究人员在HUCCT1和RBE两种胆管癌细胞系中进行了基因敲低实验。他们设计了三条针对人NOTCH2的小干扰RNA(siRNA)和一条阴性对照(NC)序列。转染后，qRT-PCR检测显示，第三条siRNA(siNOTCH2#3)在两种细胞系中均展现出最显著的NOTCH2 mRNA敲低效率。集落形成实验结果表明，敲低NOTCH2后，两种细胞系的细胞克隆形成数量均显著减少。此外，CCK-8细胞活力检测也显示，在敲低NOTCH2 24、48和72小时后，HUCCT1和RBE细胞系的细胞活力均显著降低。这些实验结果有力地证明了NOTCH2在促进胆管癌细胞增殖和维持细胞活力中发挥着关键作用。

NOTCH2表达与药物敏感性相关

探索NOTCH2的潜在临床转化价值，研究人员从CellMiner数据库下载了RNA表达矩阵和药物敏感性数据，分析了NOTCH2表达水平与潜在药物活性Z-score之间的相关性。筛选结果发现，氨萘菲特(AMONAFIDE)的活性与NOTCH2表达呈负相关，即在NOTCH2低表达组中该药物活性更高。相反，依维莫司(Everolimus)、硝唑尼特(Nitazoxanide)和雷帕霉素(RAPAMYCIN)的活性与NOTCH2表达呈正相关，在NOTCH2低表达组中活性较低。这一发现提示，对于NOTCH2高表达的胆管癌患者，尽管其预后较差，但可能对mTOR抑制剂（如依维莫司和雷帕霉素）具有治疗敏感性，为精准治疗提供了线索。

该研究通过多层次、多角度的证据链，确立了JAG1-NOTCH2信号轴在胆管癌中的关键驱动作用。研究不仅揭示了NOTCH2作为胆管癌不良预后的独立预测标志物，还通过功能实验证实了其促进肿瘤细胞增殖的能力。更重要的是，药物敏感性分析将NOTCH2表达与特定药物（尤其是mTOR抑制剂）的疗效联系起来，提出了基于NOTCH2表达水平对胆管癌患者进行分层的精准治疗新策略。这意味着未来临床上或可通过检测患者肿瘤组织的NOTCH2表达水平，来筛选可能从mTOR抑制剂治疗中获益的人群，为改善这种难治性癌症的预后带来了新的希望。当然，研究者也坦诚指出了本研究的局限性，如样本量相对较小、生存分析数据混合了不同胆管癌亚型等，这些都需要在未来更大规模的独立队列和前瞻性研究中进一步验证。同时，更复杂的实验验证也将有助于阐明NOTCH2在胆管癌中的具体作用机制。总之，这项研究为理解胆管癌的分子机制提供了新的视角，并为开发新的预后工具和靶向治疗策略奠定了坚实的基础。