DAZAP1通过m6A-USP34-PIN1-MAPK轴驱动胃癌进展及化疗耐药性的机制研究

《Cell Biology and Toxicology》：DAZAP1 promotes cancer progression and chemotherapy resistance by stabilizing PIN1 protein in gastric cancer

本研究针对胃癌治疗中缺乏有效分子靶点及化疗耐药性难题，系统揭示了RNA结合蛋白DAZAP1在胃癌中的致癌作用。研究人员通过单细胞转录组分析发现DAZAP1在增殖性胃癌细胞中显著富集，进而利用功能实验证实DAZAP1通过稳定USP34 mRNA促进PIN1蛋白去泛素化，激活MAPK信号通路，最终驱动胃癌进展和化疗耐药。尤为重要的是，研究首次发现DAZAP1表达受m6A修饰调控，ALKBH5通过去甲基化作用保护DAZAP1 mRNA免受YTHDF2介导的降解。该研究为胃癌靶向治疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率位居恶性肿瘤第三位，严重威胁人类健康。尽管近年来诊疗技术不断进步，但晚期胃癌患者仍面临治疗选择有限、化疗耐药等严峻挑战，导致预后较差。因此，深入探索胃癌发生发展的分子机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点，成为当前胃癌研究领域的迫切需求。

在这项发表于《Cell Biology and Toxicology》的研究中，张培玲等研究人员将目光投向了一个相对新颖的分子——DAZAP1（Deleted in azoospermia-associated protein 1）。DAZAP1是一种异质性核RNA结合蛋白，参与多种细胞过程，包括可变剪接、RNA翻译和降解等。然而，DAZAP1在胃癌中的具体功能和调控机制尚不明确。

为了回答这些问题，研究团队开展了一系列严谨的实验。他们首先整合了四个公共单细胞RNA测序数据集，通过UMAP降维分析和细胞聚类，发现DAZAP1在增殖性癌细胞中显著富集，且在S期和G2/M期表达最高。CopyKAT分析进一步显示DAZAP1在具有高拷贝数变异（CNV）的恶性细胞中优先表达。这些发现提示DAZAP1可能与胃癌细胞的增殖和恶性进展密切相关。

研究人员采用的主要技术方法包括：单细胞RNA测序分析（整合GEO数据库四个数据集）、体外功能实验（MTT法、集落形成、EdU染色）、流式细胞术（细胞周期和凋亡分析）、动物实验（裸鼠异种移植模型）、质谱分析、RNA免疫共沉淀（RIP）、m⁶A点印迹、甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）等。研究队列包括45例未接受过抗癌治疗的胃癌患者组织样本，以及TCGA和GEO数据库的公共数据。

1. 单细胞转录组图谱揭示DAZAP1在增殖和恶性胃癌细胞中富集

通过整合分析多个单细胞RNA测序数据集，研究人员发现DAZAP1在增殖性癌细胞群体中显著富集。细胞周期分析显示DAZAP1表达在S期和G2/M期达到峰值，表明其与DNA复制和有丝分裂活动密切相关。CopyKAT分析进一步证实DAZAP1在具有高CNV负荷的细胞中优先表达，这些细胞代表基因组不稳定和恶性群体。大样本分析验证了DAZAP1在胃癌组织和细胞系中mRNA和蛋白水平的显著上调，且高表达与患者不良预后相关。

2. 抑制DAZAP1 suppresses suppresses GC增殖并诱导凋亡

通过构建DAZAP1敲低的AGS和BGC823细胞系，研究人员发现DAZAP1 knockdown显著抑制了胃癌细胞的增殖能力。集落形成实验和EdU染色实验进一步证实了这一结果。流式细胞术分析表明DAZAP1敲低导致G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞减少，引起细胞周期阻滞。同时，DAZAP1敲低还提高了细胞凋亡率。体内实验显示，注射DAZAP1敲低细胞的裸鼠肿瘤体积和重量显著减小，生长速率明显减慢。

3. 升高的DAZAP1 enhances GC增殖和细胞周期进程

与敲低实验相反，DAZAP1过表达显著增强了胃癌细胞的增殖能力。MTT实验、集落形成实验和EdU实验均显示DAZAP1过表达细胞具有更强的增殖活性。流式细胞术分析发现DAZAP1过表达显著增加了G2期细胞比例。体内实验进一步证实DAZAP1过表达促进肿瘤生长，肿瘤体积和重量均显著增加。

4. DAZAP1 contributes to多重化疗耐药 in GC

临床数据分析显示，化疗耐药组患者中DAZAP1表达显著上调。TCGA数据分析表明高DAZAP1表达与5-FU（5-氟尿嘧啶）、奥沙利铂和顺铂敏感性降低相关。细胞实验证实DAZAP1敲低增强了化疗药物诱导的细胞死亡，而过表达则减弱了5-FU的促凋亡效应。值得注意的是，DAZAP1敲低并不影响经典耐药基因（如ABCB1、ABCG2等）的表达，表明其介导的化疗耐药不依赖于传统的药物外排转运体或DNA修复途径。动物实验进一步验证了DAZAP1敲低与奥沙利铂联合使用可显著抑制肿瘤生长。

5. DAZAP1通过增强PIN1蛋白稳定性激活MAPK信号通路

质谱分析筛选出30个受DAZAP1调控的差异表达基因，其中PIN1因其在肿瘤中的重要作用被选为候选靶点。实验证实DAZAP1过表达增加PIN1蛋白水平，而敲低则降低其表达。蛋白质稳定性实验显示DAZAP1敲低缩短PIN1半衰期，过表达则延长其半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132处理可部分挽救DAZAP1敲低引起的PIN1降解，表明DAZAP1通过抑制泛素-蛋白酶体途径稳定PIN1。救援实验表明PIN1 siRNA可部分逆转DAZAP1过表达促发的增殖和化疗耐药表型。KEGG通路分析显示MAPK信号通路在DAZAP1敲低细胞中变化最显著，Western blot验证DAZAP1敲低降低p-ERK1/2水平，而过表达特异性升高p-ERK1/2。

6. DAZAP1通过RNA介导的USP34依赖性机制稳定PIN1

机制探索发现DAZAP1敲低显著增强PIN1多泛素化水平。catRAPID生物信息学分析预测USP34 mRNA是DAZAP1的潜在结合靶点，RIP实验证实两者直接相互作用。放线菌素D追踪实验显示DAZAP1敲低 substantially diminished USP34 mRNA稳定性。DAZAP1敲低下调USP34 mRNA和蛋白表达，而USP34过表达可有效挽救DAZAP1敲低引起的PIN1蛋白水平下降。

7. ALKBH5通过m⁶A去甲基化增强DAZAP1表达

去甲基酶激活剂DAA处理显著增加DAZAP1 mRNA水平。TCGA数据分析显示DAZAP1与ALKBH5表达呈强正相关。ALKBH5敲低降低DAZAP1蛋白水平，m⁶A点印迹显示全局m⁶A水平显著增加。SRAMP在线工具预测DAZAP1 mRNA上存在三个高置信度m⁶A修饰位点，MeRIP-qPCR证实ALKBH5敲低增强DAZAP1 mRNA的m⁶A修饰。放线菌素D实验表明ALKBH5敲低加速DAZAP1 mRNA衰变。RIP-qPCR验证YTHDF2直接结合DAZAP1 mRNA。

本研究系统阐明了ALKBH5/DAZAP1/USP34/PIN1/MAPK轴在胃癌进展和化疗耐药中的关键作用。研究发现不仅揭示了DAZAP1作为胃癌潜在治疗靶点的重要性，还首次报道了m⁶A修饰对DAZAP1表达的转录后调控机制。特别值得注意的是，DAZAP1通过稳定USP34 mRNA间接调控PIN1蛋白稳定性的新模式，为理解RNA结合蛋白在肿瘤中的作用提供了新视角。这些发现为开发针对胃癌化疗耐药的新型联合治疗策略奠定了理论基础，具有重要的临床转化价值。未来研究可进一步探索该信号轴中各组分相互作用的分子细节，以及靶向该通路在胃癌治疗中的潜在应用前景。