CRISPR-Cas9介导的四倍体紫花苜蓿基因组编辑：编辑效率、时序及突变等位基因向有性和无性后代的传递研究

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：CRISPR-Cas9-mediated genome editing in tetraploid alfalfa: data on efficiency, timing, and transmission to the sexual and clonal progeny

本研究针对多倍体植物基因组编辑中难以实现所有等位基因同步精准修饰的难题，在四倍体紫花苜蓿中利用CRISPR-Cas9系统靶向GSA基因第二内含子，尝试通过同源定向修复(HDR)引入点突变。虽未获得HDR事件，但成功获得非同源末端连接(NHEJ)介导的缺失突变，编辑效率达28.6%，并首次系统分析了体细胞嵌合突变、无性繁殖过程中的体细胞分离以及有性后代中编辑元件的分离规律，为多倍体作物基因组编辑策略优化提供了重要数据。

　　

在植物育种领域，多倍体作物（如小麦、棉花、苜蓿等）因其基因组复杂性和多个等位基因的存在，使得通过传统育种或基因工程技术实现性状改良面临巨大挑战。特别是对于紫花苜蓿(Medicago sativa)这类重要的豆科牧草，其作为同源四倍体(2n=4x=32)植物，理论上一个基因座包含四个等位基因。利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，理论上可以同时敲除或修饰所有等位基因，从而快速获得性状均一的改良品种。然而，在实际操作中，如何高效地实现所有等位基因的同步编辑，并确保编辑事件能够稳定遗传给后代，是目前多倍体植物基因组编辑研究的核心难点之一。

本研究聚焦于利用CRISPR-Cas9系统对紫花苜蓿的谷氨酸-1-半醛氨基转移酶(GSA)基因进行精准编辑。选择该基因作为靶点有其特殊考量：此前研究发现，GSA基因的一个特定点突变可以赋予植物对除草剂Gabaculine的抗性，这为筛选成功的编辑事件提供了一个便捷的选择标记。然而，GSA是植物叶绿素合成途径中的必需基因，若编辑过程中不慎造成基因功能完全丧失（即敲除），可能会导致植株死亡或生长不良。因此，研究人员采取了更为精细的策略：他们将CRISPR-Cas9的切割位点设计在GSA基因的第二个内含子区域，而非编码蛋白质的外显子区。这样设计的目的是，即使切割后通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)方式进行修复，只要不破坏内含子的剪接信号，基因功能就有很大可能得以保留。他们同时引入了一个供体DNA模板，希望通过同源定向修复(HDR)机制将赋予Gabaculine抗性的特定点突变精确地引入到基因组中。这是一种旨在实现“精准编辑”而非简单“基因敲除”的策略。

为了开展研究，研究人员构建了一个名为pTRANS221-MsGSA的植物转化载体。该载体除了包含CRISPR-Cas9系统（由sgRNA引导的Cas9核酸酶）外，还整合了豆黄矮病毒(Bean yellow dwarf virus, BeYDV)的复制子系统(LIR-SIR-LIR)，旨在体内扩增供体DNA的数量，以期提高HDR的效率。研究人员利用实验室保存的紫花苜蓿基因型RSY1的叶片外植体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化方法，将编辑系统导入植物细胞。初步转化筛选使用卡那霉素(30 mg/L)，随后在第二轮再生培养中尝试使用Gabaculine (30 μM)进行筛选，以期富集可能发生的HDR编辑事件。

研究人员运用了多种分子生物学技术来检测和鉴定编辑事件。首先，通过PCR-限制性内切酶分析初步筛查HDR事件。随后，对于更常见的NHEJ事件，他们采用了TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) 分析和Sanger测序克隆测序法。为了获得更全面、更精确的编辑等位基因信息，特别是为了检测低频的、嵌合状态的突变，研究团队对靶位点区域进行了深度测序(Illumina AVITI平台)，并利用CRISPResso2生物信息学工具进行数据分析，能够识别出频率低至0.1%的编辑等位基因。

主要研究结果

序列分析与靶位点选择

对紫花苜蓿基因型RSY1的GSA基因进行分析时，发现了一个意想不到的情况：在这个四倍体基因型中，GSA基因并非预期的四个等位基因，而是只有三个。更深入的分析揭示，其中存在两种类型的等位基因：“标准等位基因”和“变异等位基因”。这两种等位基因在靶位点区域的序列存在差异，导致设计的sgRNA无法有效识别和切割变异等位基因。这一发现对后续编辑效率的分析和解释至关重要。

转化与编辑效率

研究共获得了14棵独立的转基因T₀代植株。通过PCR-限制性内切酶分析，未在任何转基因植株中检测到成功的HDR事件。然而，TIDE和克隆测序分析表明，14棵转基因植株中有5棵在靶位点发生了缺失突变(-1, -3, -4 或 -5 bp)。深度测序进一步证实了这些结果，并将独立的编辑事件确定为4个（因为事件2A和2G被认为是同一事件的克隆），因此计算出的编辑效率（编辑植株数/转基因植株数）为28.6%。值得注意的是，所有检测到的突变均为缺失，未观察到插入或碱基替换。

Cas9与突变等位基因在T₁代中的分离

为了研究编辑事件能否通过有性繁殖稳定遗传，研究人员将5棵编辑过的T₀代植株与一个非转基因的花粉供体（品种‘Classe’）杂交，获得了T₁代群体。通过PCR检测Cas9基因的分离情况，发现所有T₀代植株的转基因位点都符合单一位点的遗传规律。在50棵T₁代植株中，有19棵（38%）不含有Cas9转基因。更重要的是，在这19棵非转基因植株中，有8棵（42%）携带了编辑过的等位基因，表明可以通过有性分离获得不含外源转基因的编辑植株。其中一棵植株（7A-11）甚至只含有变异等位基因和一个-5 bp缺失等位基因，完全缺失了标准等位基因，这意味着该植株的两个标准等位基因都已被成功编辑。

深度测序与等位基因清单

深度测序以极高的分辨率揭示了每个植株中各种等位基因的精确比例。非转基因对照RSY1中标准等位基因与变异等位基因的比例为2:1，证实了该基因型确实只含有三个GSA等位基因。而花粉供体‘Classe’中的比例为1:1，表明其含有四个等位基因（两个标准，两个变异）。在编辑植株中，事件2A、2G和11G的缺失等位基因频率接近33%，符合“固体突变”（即编辑发生在再生单细胞）且仅有一个标准等位基因被突变的预期。事件11A的缺失等位基因频率为19.31%，明显低于33%，表明该植株处于“嵌合状态”，即其体内同时存在野生型和突变型细胞。事件7A则呈现出变异等位基因和-5 bp缺失等位基因各占约50%的状态，标准等位基因几乎检测不到，表明其标准等位基因已被完全编辑。深度测序还检测到大量频率极低（<1.17%）的缺失等位基因，这些“稀有等位基因”存在于所有转基因植株（包括未被认定为“已编辑”的植株）中，表明CRISPR-Cas9系统在植株再生后的发育过程中仍在持续产生新的DSB和NHEJ修复，导致体细胞嵌合现象。

无性繁殖与有性繁殖的结果

研究发现，通过茎插条进行无性繁殖（克隆）可以导致等位基因频率发生变化。例如，嵌合状态的事件11A，其两个克隆后代中，一个完全丢失了-1 bp缺失突变，另一个则显示出该突变频率升高至26.92%。这表明，用于产生克隆的芽起源于具有不同基因型的体细胞，无性繁殖可以促使嵌合体分离出具有不同编辑状态的固体突变体。此外，一些克隆后代中稀有等位基因的数量比母本有所增加，这可能是在克隆繁殖过程中或之后Cas9在体细胞中持续活性的结果。相比之下，有性繁殖（T₁代）并未产生新的、固体形式的突变等位基因，表明编辑机制在雌配子发生过程中可能不活跃。然而，令人惊讶的是，在不含Cas9的非转基因T₁代植株中也检测到了极少量的稀有编辑等位基因，这可能源于胚胎发育过程中母体组织中的编辑机制对胚胎细胞的极低频编辑。

研究结论与意义

本研究成功地在同源四倍体紫花苜蓿中实现了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，尽管最初设想的HDR精准编辑未能实现，但获得了可观的NHEJ介导的缺失突变效率。研究首次在紫花苜蓿中系统揭示了GSA基因座的等位基因变异情况，并详细描绘了编辑事件在多倍体背景下的复杂性。其主要意义在于：

1. 1.
   证明了多倍体紫花苜蓿中CRISPR-Cas9编辑的可行性：尽管使用单一sgRNA，仍获得了28.6%的编辑效率，表明该技术适用于紫花苜蓿遗传改良。
2. 2.
   阐明了编辑事件的遗传规律：研究证实可以通过有性繁殖分离获得不含外源转基因的编辑植株，这对于未来转基因生物监管和商业化应用至关重要。事件7A-11更是展示了在多倍体中实现特定等位基因完全编辑的可能性。
3. 3.
   揭示了体细胞嵌合与无性繁殖的价值：研究观察到CRISPR-Cas9在植物体细胞发育过程中的持续活性，导致嵌合现象。更重要的是，研究发现无性繁殖（克隆）可以作为一种有效手段，从嵌合体母本中分离出具有不同编辑状态的固体突变体，这为难以进行高效有性繁殖的多倍体无性系作物（如果树、薯类等）的基因组编辑育种提供了新思路。通过连续的无性繁殖，有可能逐步富集所需的突变组合。
4. 4.
   强调了深度测序在编辑分析中的重要性：本研究展示了深度测序在精确鉴定多倍体植物中复杂等位基因类型和频率方面的强大能力，特别是对于检测低频嵌合突变至关重要。

总之，这项研究为理解CRISPR-Cas9在多倍体植物中的编辑动力学、突变遗传以及无性繁殖在固定编辑事件中的作用提供了宝贵的见解，对推动多倍体作物的精准育种具有重要的理论和实践意义。尽管HDR在紫花苜蓿中的应用仍面临挑战，但本研究为优化编辑策略（如使用多重gRNA、不同的Cas9变体或改进的供体递送系统）奠定了基础。