综述：正常组织中的体细胞突变与克隆进化及癌症发展

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Somatic mutations and clonal evolution in normal tissues and cancer development

本综述系统阐述了正常细胞中体细胞突变（Somatic Mutations）的积累、驱动突变（Driver Mutations）的获得以及随后的克隆进化（Clonal Evolution）。作者指出，衰老、环境因素（如吸烟、饮酒）及遗传背景共同推动了这一过程，并强调了新技术（如下一代测序NGS）在解析微小克隆中的关键作用。这些发现为理解癌症起源、实现早期检测和预防提供了重要理论基础。

　　

Experimental techniques used to analyze clonal evolution in normal tissues

解析正常组织中克隆进化的技术手段正不断进步。由于正常组织中的克隆扩增规模远小于肿瘤组织，尤其是在除血液外的实体器官中，对微小克隆进行遗传分析曾面临巨大技术挑战。目前主要采用三种方法：第一种是通过激光捕获显微切割等技术采集少量细胞（如100-1000个）进行遗传分析，该方法能保留空间信息，但若克隆过小，样本可能为多克隆混合，导致体细胞突变的等位基因频率过低而难以检测。第二种是构建单细胞来源的类器官或集落进行分析，该方法的优势在于能在单细胞水平进行遗传分析，但类器官构建过程繁琐，且无法获取空间信息。第三种是利用双链测序等新型技术，其测序错误率极低（如NanoSeq技术可达到每碱基对<5×10^-9错误），可直接对大量正常细胞进行突变分析，特别适用于神经元、肌肉等细胞不分裂、难以微采样的组织。此外，单细胞DNA分析和RNA-seq也被用于检测体细胞突变和拷贝数变异。

Mechanisms of somatic mutation accumulation in normal tissues

正常细胞在癌变前，基因组异常会随着年龄增长而积累，这始于受精卵的第一次分裂，也包括与细胞分裂无关的内源性过程。研究表明，最初几次细胞分裂获得的突变数量（每次分裂2.4-3.8个）远高于后续分裂（0.7-1.2个），且这些分裂产生的子细胞以不均等方式参与组织形成。突变特征分析为了解体细胞突变获取过程提供了许多见解。尽管不同器官的突变数量和积累过程略有差异，但内源性突变获取是所有器官普遍存在的。

内源性突变过程中，单碱基替换签名SBS1和SBS5/40被认为是常见的“时钟样”签名，其突变数量与年龄相关。SBS1以CpG位点的C>T突变为特征，反映了5-甲基胞嘧啶的自发脱氨基作用，可见于大多数组织，包括不分裂的神经元和肌肉细胞。SBS5特征相对平坦，以C>T和T>C突变轻度增加为特点，其成因尚不清楚，但在血液、大脑和肌肉等组织中均随年龄增长而积累，提示其通过与非细胞分裂相关的内源性过程积累。SBS18特征反映活性氧（ROS）引起的DNA损伤，在结肠、子宫内膜和胃黏膜等正常上皮组织中随年龄增长而被发现。SBS9特征则在正常记忆B细胞中随年龄增长，源于易错DNA聚合酶η绕过背景DNA损伤或由活化诱导胞苷脱氨酶介导的体细胞超突变。

在具有先天性DNA聚合酶ε或δ胚系突变（即聚合酶校对相关息肉病）的个体中，肠道隐窝的SBS数量显著高于正常人，其中SBS10和SBS28特征与POLE胚系突变相关，SBS10特征与POLD1胚系突变相关。相反，在林奇综合征（由MLH1、MSH2等DNA错配修复基因胚系突变引起）患者中，结肠上皮细胞的突变数量并未增加，提示单等位基因突变可能不足以损害DNA错配修复功能。携带BRCA1/2胚系突变的个体，其正常乳腺细胞中非整倍体频率也更高。

外源性因素同样诱导体细胞突变。吸烟在直接接触烟草烟雾的器官（如肺、喉）中诱导SBS4特征（以C>A突变为特征），并在正常支气管上皮细胞中增加SBS4、SBS5和SBS16特征，以及类似烟草烟雾中亚硝胺诱导的新突变特征Sig-B。饮酒与食管癌高风险相关，在饮酒者的食管上皮细胞中，与酒精相关的SBS16特征（Sig. D）增加，且携带ALDH2失活变异的个体其SBS16突变积累速率更高。紫外线辐射导致SBS7特征（以嘧啶二聚体处的C>T突变为特征），最初在皮肤癌中发现，后也在正常表皮细胞、黑色素细胞和角质形成细胞中检测到。有趣的是，SBS7特征也出现在急性淋巴细胞白血病和正常B、T淋巴细胞中，提示细胞在皮肤中时可能因紫外线暴露而获得该特征。

肠道菌群中某些携带pks岛的大肠杆菌菌株可引起动物细胞DNA双链断裂，具有基因毒性。将pks阳性大肠杆菌给予结肠类器官可诱导特征性突变签名，与正常结肠隐窝中发现的SBSA签名（即SBS88）匹配。化疗药物也会在正常细胞中诱导突变，如5-FU（SBS17）和铂类（SBS35）的突变特征在化疗后的正常结肠上皮细胞中被发现；马法兰（SBS99）等烷化剂的突变特征在化疗后的血细胞中也有报道。马兜铃酸暴露则导致以T>A突变为特征的SBS22签名，在肝细胞癌、膀胱癌以及正常肝细胞和膀胱上皮细胞中均有发现。

电离辐射可引起遗传异常积累，但尚未发现特征性的SBS签名。然而，一种新的插入-缺失突变签名ID-A被认为反映了辐射诱导的随机DNA双链断裂导致的缺失增加，其部分特征为具有微同源的缺失增加，类似于与非同源末端连接相关的缺失签名ID8。此外，还观察到染色体结构异常的增加，其断点具有微同源性，提示通过非同源末端连接进行修复。

Driver mutation acquisition in normal cells

研究表明，携带特定基因组异常的克隆会在正常组织中被选择。这些异常包括癌症中常见的驱动基因突变，或以不同于癌症的模式获得的基因组异常。

在血液中，单核苷酸多态性阵列分析检测到携带染色体异常（如del(20q)、del(13q)、del(11q)、del(17p)、+12、+8）的血细胞克隆扩增，这些异常在血液恶性肿瘤中常见。下一代测序分析进一步揭示，携带TET2、DNMT3A、ASXL1等髓系肿瘤常见驱动突变的克隆会导致克隆造血，这与心血管疾病、脑血管疾病等年龄相关疾病的发生有关，但有趣的是，也与阿尔茨海默病风险降低相关。高灵敏度分析显示，75岁以上个体几乎都存在克隆造血。不同基因发生突变的风险和进展至血液恶性肿瘤的风险不同，例如U2AF1、SRSF2、SF3B1等RNA剪接因子基因的突变主要在老年人中检测到，进展为白血病的风险较高；而DNMT3A和TET2突变在克隆造血中最常见，在相对年轻时获得，进展风险较低。对骨髓增殖性肿瘤的分析发现，JAK2、DNMT3A等驱动突变常在胎儿期或幼年时期获得。

利用微采样技术进行的基因组分析揭示了正常组织中携带驱动突变的克隆的空间扩增。在皮肤鳞状上皮中，携带NOTCH1和TP53突变的克隆扩增频繁发生，约20%的皮肤细胞存在NOTCH1突变，且携带驱动突变的克隆规模大于无驱动突变的克隆。在食管细胞中，也观察到NOTCH1和TP53突变克隆的扩增，这种组织重塑由驱动突变克隆推动，并随衰老、吸烟、饮酒等环境因素而进展。与血细胞类似，这些驱动突变常在生命早期获得，NOTCH1突变甚至在婴儿期就已获得，在没有吸烟、饮酒等致癌风险因素的年轻健康个体中也观察到小克隆的扩增。

在子宫内膜中，子宫内膜癌常见的KRAS和PIK3CA突变在儿童期（10岁前）就已获得。在正常乳腺上皮中，乳腺癌常见的拷贝数变异（如der(1;16)、+1q、del(16q)）以及PIK3CA突变经常存在，并从青春早期到晚期出现。在正常膀胱中，染色质重塑基因（如KMT2D、KDM6A）的突变频繁发生，且常出现趋同进化现象，即同一样本内不同克隆独立获得同一基因的不同突变，提示这些突变是强驱动因素。类似地，在正常胃黏膜上皮中，也频繁观察到ARID1A、KDM6A等染色质重塑基因的突变。

然而，有些器官中驱动突变获得导致的克隆扩增较少发生。例如，正常结肠上皮中驱动突变频率相对较低（约1%），这是因为结肠由源于单个干细胞的隐窝单位构成，即使获得驱动突变，也很少通过破坏隐窝结构导致克隆扩增。正常前列腺上皮中驱动突变的克隆扩增也较少见，因为干细胞来源的细胞在物理上是分离的，位于不同区域。同样，正常肝脏中携带驱动突变的克隆频率也较低（<5%）。

在某些组织中，克隆会获得疾病特异性的驱动突变。在血液中，再生障碍性贫血（涉及致病性自身免疫机制）患者体内频繁出现PIGA突变和6p染色体拷贝数中性杂合性缺失（靶向HLA区域），获得这些异常的克隆通过免疫逃逸适应环境。在酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病等慢性肝病中，肝细胞获得代谢相关基因（如FOXO1、CIDEB、GPAM1）的突变，这可能保护细胞免受脂毒性损伤。在炎症性肠病（如克罗恩病、溃疡性结肠炎）患者的结肠上皮中，携带白细胞介素-17信号通路相关基因（如NFKBIZ、TRAF3IP3、ZC3H12A）突变的克隆被选择，这些突变帮助细胞逃避慢性炎症损伤。

在先天性骨髓衰竭综合征（也是癌症易感综合征）中，报道了适应遗传背景的驱动突变获得和克隆进化。在端粒生物学疾病（如先天性角化不良）中，发生TERT启动子和POT1突变以补偿端粒功能障碍。在Shwachman-Diamond综合征中，存在EIF6突变和涉及EIF6的del(20q)，以补偿核糖体成熟缺陷。在SDS等隐性遗传疾病中，有报道称克隆通过获得拷贝数中性杂合性缺失或拷贝数变异，增加两个致病等位基因中相对有功能等位基因的数量，从而恢复功能，这种遗传改变称为适应性救援。相反，获得TP53突变的克隆则逃避由端粒或核糖体功能障碍诱导的TP53激活所导致的凋亡，并常进展为髓系恶性肿瘤，这一过程称为适应不良性救援。

Clonal evolution in normal tissues and progression to precancerous lesions and cancer

克隆造血增加了血液恶性肿瘤的风险。髓系克隆造血与髓系肿瘤发展相关（风险比HR=7.0），淋巴系克隆造血与淋巴系肿瘤发展相关（HR=4.2）。估计每年有0.5%-1%的可检测到克隆造血的个体会发展为血液恶性肿瘤。对纵向收集样本的分析表明，克隆扩增在5-10年内逐渐发生，最终导致血液恶性肿瘤。对骨髓增殖性肿瘤的分析显示，从获得初始驱动突变（如JAK2 V617F）到发病平均约30年，获得第二个驱动突变进而导致肿瘤发生则需要数十年。

对同一病例的正常乳腺上皮细胞、癌前病变和癌症进行的系统发育分析提示，在青春早期到晚期获得der(1;16)后，需要超过10年时间通过获得进一步的驱动突变发展为乳腺癌。值得注意的是，多个独立的癌灶源于一个共同的携带der(1;16)的非癌性克隆，这展示了不同于传统单一起源癌模型的新模式。

对正常组织克隆与癌前病变或癌症克隆差异的研究发现，在膀胱、肝脏和支气管中，正常细胞克隆的突变数量和拷贝数变异显著低于同一个体的癌症组织。相反，在正常乳腺组织和同一个体癌症组织之间，驱动突变的数量和类型没有显著差异，提示表观基因组变化可能对表型差异有贡献。尽管获得早期驱动突变后正常细胞表型变化的细节尚不清楚，但造血干细胞获得驱动突变确实增加了克隆扩增速率。

一些在正常组织中常见且伴随克隆扩增的驱动突变（如皮肤、食管和支气管组织中的NOTCH1突变）在癌症中相对少见。小鼠模型研究表明，Notch1突变促进正常食管上皮细胞增殖，同时抑制癌细胞增殖，提示突变Notch1克隆可能起抑制肿瘤发生的作用。相反，几种癌症中的典型驱动基因，如多种组织中的TP53、膀胱中的FGFR3、子宫内膜中的PTEN，在正常组织中的发生频率低于癌症。

毫无疑问，遗传背景影响着从正常细胞到癌症的克隆进化过程。携带TCL1A启动子区域单核苷酸多态性的个体，其由TET2和ASXL1突变驱动的克隆造血扩增受到抑制。该单核苷酸多态性的存在通过这些驱动突变诱导的TCL1A表达，抑制了造血干细胞克隆的扩增。

Summary

本综述概述了正常细胞中体细胞突变的积累、驱动突变的获得以及随后由各种因素引起的克隆进化。尽管过去十年取得了实质性进展，但仍有许多方面了解甚少，例如遗传背景的影响以及遗传背景与环境因素之间的相互作用。在克隆造血中，克隆扩增常在没有获得驱动突变的情况下发生，这表明除了基因组异常外，表观基因组突变等非基因组异常也可能部分解释克隆进化。驱动基因突变诱导细胞表型改变的机制，以及为何只有有限数量的正常组织克隆扩增会演变为癌症，其原因尚不清楚。此外，在戒烟后，正常支气管上皮中观察到烟草相关遗传突变较少的克隆增加，这表明针对环境变化发生的克隆进化或更替机制仍有待阐明。预计这些方面的研究将取得进展，从而更深入地理解致癌作用，并最终为癌症的早期检测和预防做出贡献。