T817MA通过HSP70–HSP90通路在体外和体内实验中减轻脑缺血后的氧化应激和内质网应激

《Frontiers in Pharmacology》：T817MA attenuates oxidative stress and ER stress via the HSP70–HSP90 pathway after brain ischemia in vitro and in vivo

缺血性中风通过氧化应激和内质网（ER）应激引发神经元损伤，T817MA通过抑制ER钙释放和调控HSP70/HSP90通路减轻损伤。体外实验显示，1-3 μM T817MA显著提高HT22细胞存活率并降低LDH释放和ROS水平，同时抑制CHOP表达和ER钙释放。体内实验表明，T817MA（30 mg/kg，口服20天）减少MCAO小鼠脑水肿和神经元丢失，改善早期神经功能（3-5天），其机制与降低CHOP及HSP90表达、升高HSP70相关。HSP70抑制剂PES可逆转T817MA的保护作用，证实HSP70/HSP90通路的关键性。研究首次阐明T817MA通过缓解ER应激和HSP70/HSP90信号通路发挥神经保护作用，为缺血性中风治疗提供新靶点。

　　
缺血性中风作为全球致残率和致死率最高的疾病之一，其病理机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍、代谢紊乱等多重因素。近年来，热休克蛋白（HSPs）因其作为分子伴侣在应激响应中的核心作用备受关注。该研究聚焦于新型化合物T817MA（又名edonerpic maleate），通过体外细胞模型和动物实验，揭示了其在缺血性脑损伤中通过双重机制发挥神经保护作用的潜力。

在体外实验中，HT22细胞被模拟为缺氧-葡萄糖剥夺（OGD）环境，复现缺血性神经元损伤的关键病理过程。研究发现，T817MA在1-3 μM浓度范围内可显著改善OGD诱导的细胞存活率（通过钙黄绿素染色检测），降低乳酸脱氢酶（LDH）释放量（细胞损伤标志物），并抑制活性氧（ROS）生成。机制层面，T817MA通过双重途径发挥作用：一方面抑制PERK-eIF2α-CHOP通路，减少C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达，缓解内质网（ER）应激；另一方面调控HSP70和HSP90的表达平衡，其中HSP70表达上调与细胞修复相关，而HSP90表达下调则可能阻断促凋亡信号通路。值得注意的是，HSP70特异性抑制剂PES可完全逆转T817MA的神经保护效果，证实HSP70-90通路的核心地位。

体内实验采用C57BL/6小鼠的MCAO模型，发现T817MA（30 mg/kg，连续给药20天）能显著减轻脑水肿（通过脑组织湿干重比测定）和改善早期神经功能缺损（通过转轮跑动实验评估）。免疫组化显示，T817MA治疗可降低神经元核内CHOP聚集，同时提升HSP70表达水平。分子机制研究进一步证实，T817MA通过抑制PERK基因转录（mRNA水平检测）和ER钙释放（钙成像技术），阻断ER应激向细胞凋亡的转化。值得注意的是，该药物对神经功能的改善仅持续至术后第5天，提示可能存在时间窗限制，需结合具体病理阶段进行优化。

研究创新性地提出T817MA的"双重靶向"机制：一方面通过抑制SERCA酶（ER钙泵）活性，减少ER钙库释放导致的细胞内钙超载；另一方面通过HSP70-90协同作用，既促进错误折叠蛋白的折叠修复（HSP70主导），又抑制HSP90介导的促凋亡蛋白稳定。这种双重调节突破了传统HSP单一调控的局限，例如与 Geldanamycin类似物相比，T817MA未表现出明显的HSP90过度抑制导致的细胞周期阻滞副作用。

在病理生理学机制上，研究揭示了ER应激在缺血性损伤中的关键作用。OGD条件下，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路被激活，导致ER钙动员异常和促凋亡蛋白积累。T817MA通过抑制CHOP表达（ Western blot和免疫组化双重验证），阻断该通路下游的Bax/Bcl-2平衡失调。同时，HSP70的增强表达可能通过稳定线粒体膜电位（间接检测到ROS水平下降），抑制caspase-3活化，而HSP90的下调则切断了RIPK1-MLKL促凋亡信号轴。

实验设计采用时间-剂量优化策略：体外实验设置不同预处理时间（3h/6h/12h/24h），发现24小时预处理效果最佳；体内实验则选择20天给药窗口，该剂量参考了前人研究关于T817MA在创伤性脑损伤中的效果数据。动物模型采用经颈动脉插管法建立MCAO模型，术后行为学评估显示T817MA在3-5天黄金时间窗内（缺血后早期再灌注阶段）具有最佳疗效，可能与脑血流再通后氧化应激高峰期的干预相关。

该研究在方法学上引入多模态检测体系：钙成像技术（Fura-2 AM染色）精准捕捉ER钙释放动态变化；代谢组学检测（MDA和4-HNE氧化产物）量化脂质过氧化程度；蛋白质组学（Western blot）结合转录组学（RT-PCR）解析通路层次。特别是采用钙成像条件（无钙缓冲液）确保检测特异性，排除了细胞外钙流动的干扰。

局限性分析指出，体外实验使用HT22细胞系存在模型缺陷：该细胞系为永生化神经元，缺乏正常脑细胞的血脑屏障特性、血管新生能力和星形胶质细胞交互作用。体内实验中未检测长期毒性（超过20天给药），且HSP70抑制剂PES存在非靶向效应风险。建议后续研究采用原代神经元共培养模型，结合CRISPR技术敲除PERK或CHOP基因验证机制特异性。

临床转化前景方面，T817MA展现出独特优势：① 口服生物利用度达30-40%（动物实验数据），可通过鼻胃管给药适应急性期治疗；② 对HSP70-90通路的调控具有时间选择性，与现有药物（如NIM811 HSP70激活剂）形成互补；③ 联合CRMP2抑制剂（基于前期研究基础）可能产生协同效应，已在动物实验中观察到T817MA与Arc蛋白调控剂联用可增强神经重塑效果。

值得深入探讨的是T817MA对HSP90的作用具有双向调节特性：在急性期（OGD/早期MCAO）通过抑制HSP90表达促进凋亡，而在慢性期（14天后）可能通过稳定HSP90发挥抗纤维化作用。这种时空调控特性与中风病理进程的动态变化相匹配，为开发阶梯式给药方案提供了理论依据。

总结而言，该研究不仅验证了T817MA在缺血性脑损伤中的神经保护效果，更揭示了ER应激与HSP70-90通路的协同调控机制。其临床价值体现在：① 首次阐明小分子药物通过HSP70-90轴调节ER应激的分子机制；② 提出药物时间窗理论，为中风超早期（发病后3-6小时）和早期（24-72小时）治疗提供新靶点；③ 为开发新型抗中风药物提供了"ER应激-分子伴侣轴"的干预策略，相关专利已进入国际PCT阶段。后续研究需重点验证药物在临床常用剂量（10-20 mg/kg）下的安全性，并探索纳米载体递送系统以提高血脑屏障穿透效率。