利用基于CRISPR的筛选方法鉴定血管钙化的表观遗传调控因子

《Journal of the American Society of Nephrology》：Identification of Epigenetic Regulators of Vascular Calcification with a CRISPR-Based Screen

CRISPR筛选结合磁激活细胞分选首次揭示血管钙化关键基因和通路，表观遗传调控因子通过整合转录组数据鉴定出17个核心调控者，其中ANTXR1在人类样本和小鼠模型中均证实其调控钙化作用，敲低抑制钙化而过表达促进钙化及VSMCs成骨分化。

　　

摘要 通俗语言总结

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要点

• 首次使用基于磁激活细胞分选的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）筛选技术，识别出与血管钙化相关的关键基因和通路。
• 以表观遗传学为重点的CRISPR筛选发现了新的血管钙化调控因子，这些因子在与转录组学结合使用时可作为潜在的治疗靶点。

背景

血管钙化主要是由血管平滑肌细胞（VSMCs）的成骨性转分化引起的，这是慢性肾病（CKD）患者中常见的病理现象。然而，其他表观遗传调控因子在这一过程中的作用仍大多尚未被探索。规律间隔短回文重复序列（CRISPR）筛选是一种高效的技术，常用于识别与各种生物过程相关的基因。但由于缺乏合适的细胞分选方法，这项技术尚未应用于血管钙化的基因筛选中。

方法

我们在原代人VSMCs中进行了以表观遗传学为重点的CRISPR筛选，通过磁激活细胞分选技术分离出NF-κB受体激活因子阳性（钙化）和NF-κB受体激活因子阴性（非钙化）的VSMCs，并基于小引导RNA的富集情况，识别出与成骨性转分化相关的关键基因和通路。为了验证筛选结果，我们通过小干扰RNA干预和茜素红S染色对不同排名的候选基因进行了验证。将CRISPR结果与转录组数据整合后，发现了17个关键的调控因子。我们进一步通过分析临床人类样本和小鼠模型中的ANTXR1基因表达情况，研究了其在中枢血管钙化中的作用。

结果

通过CRISPR筛选，我们发现了122个可能促进血管钙化的正向调控基因和116个可能抑制血管钙化的负向调控基因。表型实验结果进一步证实了这些基因在VSMCs成骨性转分化中的作用，增强了我们CRISPR筛选系统的有效性。值得注意的是，CRISPR筛选与转录组数据的综合分析表明ANTXR1是调控血管钙化的关键因子。此外，临床人类样本检测证实了ANTXR1在钙化过程中的上调表达。敲低ANTXR1基因可抑制小鼠模型中的血管钙化；相反，其过表达则会促进血管钙化和VSMCs的成骨性转分化。

结论

我们的以表观遗传学为重点的CRISPR筛选和转录组分析，识别出了与血管钙化相关的关键表观遗传基因。

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通俗语言总结：本研究采用了一种新的CRISPR筛选技术与磁激活细胞分选方法，识别出与血管钙化相关的基因和通路。血管钙化是慢性肾病（CKD）中的常见病症。研究人员重点研究了血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表观遗传调控因子，发现了238个可能促进或抑制钙化的基因。研究证实了炭疽毒素受体1（ANTXR1）是关键调控因子，这一结论通过人类样本和小鼠模型得到了验证。敲低ANTXR1基因可减少血管钙化，而其过表达则会增加血管钙化。这种方法为血管钙化的遗传机制提供了新的见解，并为治疗干预提供了潜在的靶点。

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