面向即时诊断的微型化等温扩增与光定量技术：铜绿假单胞菌快速检测新平台

《IEEE Open Journal of Engineering in Medicine and Biology》：Miniaturized Devices for Isothermal Amplification and Photometric Quantification of Pseudomonas Aeruginosa

本研究针对铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)传统检测方法耗时、操作复杂等问题，开发了一种集成重组酶聚合酶扩增(RPA)与微型化光检测的原型装置。该装置可在15分钟内完成0.04 ng DNA的检测，具有高灵敏度、特异性及成本效益，结合物联网(IoT)云平台实现远程监控，为资源有限机构提供了便捷的即时诊断(POCT)解决方案。

　　

在医疗感染控制领域，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作为一种常见的革兰氏阴性机会致病菌，已成为医院获得性肺炎、尿路感染和囊性纤维化等严重感染的主要元凶。传统检测方法如细菌培养和免疫学技术虽广泛应用，但存在耗时长（通常需要2-5小时）、操作繁琐且依赖专业实验室的局限。尤其在高负担医疗环境中，快速、精准的病原体检测手段对于及时干预和疾病防控至关重要。尽管分子诊断技术如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)具有高灵敏度，但其对热循环仪的依赖、高成本以及需要熟练技术人员等缺点，限制了其在资源有限场景下的应用。因此，开发一种设备无关、操作简便且快速的现场检测平台成为当前研究的迫切需求。

为应对这一挑战，Ramya Priya、Satish Kumar Dubey和Sanket Goel团队在《IEEE Open Journal of Engineering in Medicine and Biology》上发表了一项创新研究，提出了一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)的微型化设备，用于铜绿假单胞菌的等温扩增和光定量检测。该研究旨在通过集成微流体技术、温度管理系统和光检测单元，实现病原体的快速、低成本诊断，并借助物联网(Internet of Things, IoT)云平台进行数据远程监控，为即时诊断(Point-of-Care Testing, POCT)提供了新的技术路径。

本研究采用了几项关键技术方法：首先，设计了一个由微控制器（Arduino nano）驱动的温度管理系统，使用DS1620双列直插式恒温器传感器和MOSFET驱动电路，精准控制微反应器在37°C–40°C的等温条件下进行RPA反应；其次，构建了以LED（峰值波长470 nm）为光源、光电二极管（S1087型）为检测元件的微型化光检测单元，通过跨阻抗放大器电路将光信号转换为电压输出，实现对SYBR Green I标记的扩增产物的实时定量；此外，利用ThingSpeak云平台实现了检测数据的远程访问和监控。临床样本来源于海得拉巴一家眼科医院的患者眼部分离物，靶基因为铜绿假单胞菌外膜脂蛋白基因oprL。

III. 结果

A. 加热器传感器电路

研究人员开发了一套基于微控制器的温度管理系统，该系统采用DS1620双列直插式恒温器传感器和MOSFET驱动电路，能够精确控制定制筒式加热器的温度。

加热器、传感器和驱动电路均由Arduino nano微控制器统一控制，确保温度稳定在37°C。实验数据显示，系统在3.5分钟内即可达到设定温度，并保持稳定，为RPA反应提供了可靠的温度环境。

B. 检测/定量单元

检测单元采用LED-光电二极管组合，通过跨阻抗放大器电路将光电二极管产生的电流信号转换为电压信号。

该系统设计了低通滤波器以抑制噪声，确保检测结果的重复性。当SYBR Green I染料与DNA结合后，在497 nm处有最大吸收，发射波长520 nm的光信号被光电二极管捕获，输出电压与DNA浓度呈线性关系（R² = 0.95），实现了对DNA浓度的定量分析。

IV. 讨论

A. PCR反应条件的建立

通过对比三种不同PCR预混液（DreamTaq Green PCR Master Mix、SYBR Green Master Mix等）的性能，研究人员验证了oprL引物对铜绿假单胞菌DNA的扩增效果。电泳结果显示，扩增产物在504 bp处出现清晰条带，为后续RPA实验提供了基准。

B. RPA实验的设计与验证

采用TwistAmp Basic试剂盒，在微反应器（容积60 μL）中进行RPA扩增。结果显示，该装置成功扩增出504 bp的oprL基因片段，且阴性对照无扩增，证明了RPA在微型化平台上的可行性和特异性。

C. 检测/定量原理

通过测试不同DNA浓度（25–125 ng/μL）与SYBR Green I结合后的光响应，校准曲线显示电压输出与DNA浓度呈正相关，验证了光检测系统的定量能力。

D. 物联网支持的实时远程监控

利用ThingSpeak云平台，检测数据可实时上传并通过智能手机访问，实现了远程监控和数据存储，为病原体传播的早期预警提供了技术支持。

本研究成功开发了一种集成RPA与微型化光检测的原型设备，可在15分钟内实现对铜绿假单胞菌的高灵敏度检测（检测限0.04 ng）。该平台无需昂贵实验室设备，操作简便，且通过IoT云平台实现了数据远程访问，显著提升了现场检测的便捷性和效率。此外，RPA试剂可适配纸基侧流层析条带，进一步扩展至病毒检测、水质监测等应用场景。该研究为资源有限环境下的病原体快速诊断提供了成本效益高、准确性强的解决方案，推动了等温核酸扩增技术(Isothermal Nucleic Acid Amplification Technology, INAAT)在POCT领域的应用。