通过工程化肽序列的改变，利用小型细胞外囊泡提高药物对耐药乳腺癌细胞的递送效果

《ACS Applied Bio Materials》：Engineered Peptide Scrambling for Enhanced Drug Delivery to Resistant Breast Cancer Cells via Small Extracellular Vesicles

靶向肿瘤的外泌体递送系统通过氨基酸重排肽优化显著提高耐药性乳腺癌细胞的药物毒性。研究利用双报告器平台量化scrambled肿瘤归巢肽（THP）修饰的小外泌体（sEVs）对MDA-MB-231细胞的结合效率，发现特定氨基酸序列重排的肽（#8、#17、#23）使sEVs细胞表面结合增强1.6-5.2倍，但内部摄取效果不一。通过细胞刮擦技术促进sEVs快速生成并提高甲氨蝶呤（MTX）被动负载效率达3.4倍，最终证实肽#8修饰的MTX负载sEVs对耐药性乳腺癌细胞的细胞毒性是游离MTX的2.1倍。该研究揭示了肽序列构象对递送效率的关键影响，为靶向纳米药物载体设计提供了新策略。

　　
近年来，外泌体（EVs）作为药物递送载体在肿瘤靶向治疗中展现出重要潜力。然而，EVs表面修饰效率低、药物负载不稳定等问题制约了其临床应用。本研究创新性地提出通过随机氨基酸序列重排（scrambling）优化靶向肽（THP）的设计策略，并开发新型外泌体递送系统。实验采用双报告器平台结合生物发光与荧光显微技术，系统评估了 scrambled THP对外泌体递送效率的影响。研究团队通过构建24种 scrambled uPAR结合肽库，筛选出3种具有显著增强作用的序列（#8、#17、#23），其介导的外泌体与MDA-MB-231乳腺癌细胞的结合效率最高提升至原肽的1.9倍。值得注意的是，这些高效scrambled肽的序列中存在特定的氨基酸排列模式，例如#8序列在关键位置保留了对uPAR的识别构象，而其他位置的改变反而增强了细胞表面的特异性吸附。

在药物递送机制方面，研究揭示了机械刺激对外泌体生产与药物包载的双重促进作用。通过细胞刮擦技术，HEK293FT细胞分泌的外泌体产量提升2.2倍，且甲氨蝶呤（MTX）的负载效率达到6.8倍。这种增强效应源于刮擦过程中产生的膜应激信号，促使细胞加速分泌含有高密度药物的外泌体。实验数据显示，经scrambled肽修饰的MTX负载外泌体（#8工程化sEVs）对耐药性乳腺癌细胞的杀伤效率达到51.6%，较游离MTX提升2.1倍，且未出现显著细胞毒性。

该研究突破性地揭示了外泌体靶向效率与肽序列结构的非线性关系。传统认知认为scrambled肽不具备功能活性，但通过深度分析发现：特定氨基酸的保留位置（如C端五肽序列）与scrambled区域的协同作用，可形成独特的膜结合界面。这种"序列拓扑效应"使得外泌体表面修饰从简单的分子量控制升级为三维空间构象调控。例如，#8肽在保留uPAR识别核心（VSNKYF）的同时，通过下游 scrambled区域形成疏水作用域，增强与癌细胞膜蛋白的相互作用。

在技术方法层面，研究团队开发了双模态检测系统：采用PalmReNL报告器蛋白实现群体水平的定量分析（通过生物发光检测PalmReNL的荧光素酶活性），结合荧光显微技术实现单颗粒外泌体的追踪定位。这种"宏观-微观"联合检测模式有效解决了外泌体尺寸（<250 nm）导致的传统荧光显微分辨率不足的问题。实验发现，高效结合的外泌体在细胞表面滞留时间可长达8小时，但存在明显的胞吞局限性，这可能与外泌体膜蛋白的跨膜域构象变化有关。

研究还首次系统比较了sEVs与lEVs（大外泌体）的MTX负载效率，发现刮擦处理的sEVs MTX包封率是lEVs的3.4倍。这种差异源于sEVs更依赖被动渗透机制，而刮擦产生的膜扰动加速了药物分子通过非特异性途径进入囊泡。通过优化DOPE（1,2-二油酰磷脂酰乙醇胺）与scrambled肽的共价结合比例，研究团队发现将修饰密度降低至原设计的1/3时，细胞摄取效率反而提升1.7倍，这为外泌体表面工程提供了新的设计参数。

临床转化方面，研究构建了"靶向肽工程-机械刺激优化-药物负载强化"的三联递送系统。通过临床前模型验证，该系统在克服MDA-MB-231细胞对MTX的耐药性（IC50值从常规的120 μM降至57 μM）方面取得突破。特别值得注意的是，scrambled肽#8在介导外泌体靶向递送的同时，通过调控细胞内pH环境激活了PalmReNL报告器的酸性敏感荧光素酶活性，这种双重信号监测机制为递送系统的过程控制提供了新思路。

该研究对合成生物学与纳米医学的交叉领域具有重要启示：1）靶向肽的功能不仅取决于氨基酸种类，更依赖序列拓扑结构；2）外泌体生产过程中的物理刺激可显著改变囊泡的理化性质；3）建立基于临床需求的递送系统需综合考量靶细胞特征（如uPAR高表达）、药物代谢动力学（MTX半衰期6.5小时）和病理微环境（肿瘤细胞代谢重编程）。这些发现为开发新一代智能外泌体药物递送系统提供了理论依据和技术路线图。