一种综合性1型糖链决定簇库的酶促合成方法

《ACS Catalysis》：Divergent Enzymatic Synthesis of a Comprehensive Type-1 Glycan Determinant Library

高效合成30种类型I糖胺并评估8种岩藻糖转移酶的催化效率，构建糖微阵列分析其与糖结合蛋白及抗Lewis抗原单抗的特异性互作，揭示α1-4岩藻糖基化对后续修饰的阻碍作用。

　　
糖胺聚糖（glycan）作为细胞表面重要的分子识别标志，其结构与功能的研究对疾病诊断和靶向治疗具有重要意义。本研究聚焦于类型-1糖胺聚糖 Determinants 的系统合成及其与糖结合蛋白（GBPs）和单克隆抗体的相互作用机制。类型-1 Determinants 以Galβ1-3GlcNAc为核心骨架，广泛分布于哺乳动物细胞表面，参与细胞黏附、免疫识别、肿瘤进展等关键生理过程。例如，Sialyl-Lewis A（SLeA）是胰腺癌等恶性肿瘤的标志物，而Lewis B（LeB）则是幽门螺杆菌的受体。然而，传统合成方法效率低且难以制备复杂结构，阻碍了糖组学研究与临床应用的进展。

研究团队创新性地采用酶促合成策略，通过系统筛选8种岩羊族糖基转移酶（FucTs），建立了高效、模块化的类型-1 Determinants 合成平台。该策略的核心在于利用α1-3/4 FucTs（如人源FUT3、FUT5及幽门螺杆菌Hp3/4FT）的广谱底物兼容性，突破传统合成中顺序修饰的限制。实验显示，FUT3在合成中展现出显著优势，不仅能高效催化α1-4 fucosylation，还可耐受后续的α2-6 sialylation和硫酸化修饰。例如，通过FUT3催化成功合成了首次报道的disialyl-Lewis A（DSLeA）相关结构DS-LNF II，解决了此前化学合成产率低（<20%）和酶促合成受阻的技术瓶颈。

在合成工艺优化方面，团队采用分阶段酶促反应策略。以化学合成的GlcNAc为起始底物，通过大肠杆菌β1-3半乳糖基转移酶（Cv3GalT）构建基础类型-1骨架，随后选择特定FucTs进行糖链延伸。针对多聚Lewis抗原（如LeB–LeA）的合成难题，创新性地引入内部α1-4 fucosylation技术，利用Hp3/4FT在延长链中精准定位第二个Fuc残基，实现TACAs（肿瘤相关糖抗原）的高效制备（产率>90%）。此外，通过人源Gal3ST2的硫代转移酶活性，首次实现了类型-1 Determinants的3'-硫酸化修饰，突破了传统化学修饰方法难以控制立体构型的局限。

功能验证阶段采用微阵列技术，构建包含30种类型-1 Determinants的标准化检测平台。该平台包含多种糖抗原变体：基础结构（如LeA、LeB、3'-sulfo-LeC）、扩展结构（LeC–LeC、BGH1–BGH1）以及复杂修饰型（DSLeA、6SLeC、Neu5Gc替代型）。通过对比分析发现：1）α1-4 fucosylation可显著抑制后续修饰（如sialylation或硫酸化）的酶活性，这为设计多功能糖抗原提供了关键理论依据；2）岩羊族酶（FUT3/FUT5）展现出独特的底物容忍性，既能识别天然糖链中的α1-3/4连接模式，又可适应α2-6 sialylated或硫酸化修饰的复杂环境；3）糖结合蛋白（如P-selectin、Siglec-7/9）对sialylated Lewis epitopes的识别存在显著偏好性，例如E-selectin对SLeA的亲和力是SLeX的4倍，而Siglec家族成员对α1-4 fucosylation的容忍度较低，仅能识别纯合sialylated结构。

在技术突破层面，本研究建立了首个针对类型-1 Determinants的标准化合成流程：1）起始骨架通过Cv3GalT酶促反应完成（产率96%）；2）利用筛选的FucTs进行多位点糖基化（单酶最高可完成5步修饰）；3）通过预组装糖核苷酸（如CMP-Neu5Ac）实现神经氨酸的精准定位。特别在合成6-硫酸化Lewis A（6SLeA）时，通过优化反应条件（pH 6.5、硫酸供体PAPS浓度20 mM）使产率达到85%，较传统化学合成方法提升3个数量级。

功能验证部分揭示了糖抗原与识别蛋白的深层互作机制：1）单克隆抗体7LE特异性识别终端LeA结构，而对内部修饰（如α1-2 fucosylation或sialylation）完全无响应；2）抗SLeA抗体MVT-5873展现出更广泛的识别谱，不仅能识别纯合SLeA，还可结合带有内部α1-4 fucosylation的复合结构（如LeA–BGH1）；3）血型相关抗原（BGH1、BGH2）的合成效率达70%-92%，其中BGH1–BGH1二聚体通过两次FUT3催化完成，为设计多价疫苗载体提供了新思路。

该研究在以下方面取得重要进展：首先，建立了包含8种岩羊族酶的催化数据库（表1），明确了不同酶对糖链长度的耐受性（如FUT5可催化最长5碳糖链的修饰），以及硫酸化、神经氨酸取代等修饰对酶活性的影响；其次，开发了基于微阵列的高通量检测平台，可同步评估32种糖抗原与19种GBPs/抗体的相互作用，检测效率较传统单点检测提升10倍；最后，通过合成DS-LNF II等新型糖抗原，首次实现了HMO（母乳低聚糖）类 Determinants的酶促全合成，为开发母乳模拟物或疫苗佐剂提供了新素材。

该成果对糖组学研究具有重要指导价值：1）酶促合成路线规划方面，提出了"先固定后修饰"的合成原则，即优先完成核心骨架的构建，再逐步引入可被后续酶识别的修饰位点；2）功能验证方法创新，通过微阵列技术实现了糖抗原-受体互作的系统性分析，特别在发现Siglec家族成员对Neu5Gc的弱识别特性方面具有突破性；3）技术转化潜力显著，合成的复杂糖抗原（如trifucosyl-Lewis B）可望用于新型生物传感器开发，而酶促合成平台已申请专利保护（专利号未公开）。

未来研究方向可聚焦于：1）开发连续流酶促反应系统，实现克级规模的自动化生产；2）探索金属离子（如Ca2?、Mg2?）对岩羊族酶活性的调控机制；3）构建三维糖复合物微阵列，模拟细胞表面糖环境。这些技术突破将推动糖抗原在癌症早筛（如SLeA检测灵敏度达0.1 ng/mL）、疫苗开发（如BGH1多聚体刺激免疫应答效率提升40%）等领域的应用。