黄芩素通过其抗真菌作用和抑制细胞焦亡（pyroptosis）机制，改善烟曲霉（Aspergillus fumigatus）引起的角膜炎

《International Immunopharmacology》：Baicalin ameliorates Aspergillus fumigatus keratitis by its antifungal activity and suppression of pyroptosis

BA对曲霉性角膜炎的疗效及抗炎机制研究：评估BA在安全剂量内抑制A. fumigatus生长、破坏真菌细胞结构，并通过抑制NLRP3-caspase-1-GSDMD通路减轻炎症反应，改善角膜病变。

　　
该研究系统探讨了黄芩苷（Baicalin，BA）治疗接合霉属（Aspergillus fumigatus）角膜炎的双重机制，通过体外和体内实验揭示了其抑制真菌增殖及调控宿主炎症反应的双重作用。研究团队以临床常见致病菌A. fumigatus为模型，构建小鼠角膜炎模型，通过多维度检测技术（包括CCK-8细胞毒性实验、组织病理学染色、实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附实验）系统评估BA的治疗效能与分子机制。

在安全性评价方面，研究采用细胞与动物双模型验证BA的用药安全性。体外实验显示，当BA浓度低于75μg/mL时，对角膜上皮细胞（HCECs）和腹腔巨噬细胞均无显著毒性，这一安全阈值为后续治疗剂量设定提供了依据。体内实验通过荧光素钠染色（CFS）和Draize评分法证实，BA在治疗剂量范围内未引起角膜组织损伤，有效排除了治疗过程中的药物毒性风险。

针对真菌致病机制，研究团队采用多组学联用策略：①通过最小抑菌浓度（MIC）测试证实BA对A. fumigatus具有显著抑制作用，其MIC值较临床常用药物更优；②荧光显微技术结合电子显微镜观察到BA能破坏真菌细胞壁完整性（通过抑制β-葡聚糖合成酶活性）和细胞膜通透性，同时降低真菌黏附宿主细胞的能力。值得注意的是，BA在抑制真菌生物膜形成方面展现出独特优势，其作用机制可能涉及干扰真菌表面蛋白的糖基化修饰过程。

在炎症调控方面，研究聚焦于NLRP3炎症小体- caspase-1-GSDMD信号通路。通过蛋白印迹（Western blot）和免疫荧光技术证实，BA治疗显著抑制了NLRP3蛋白表达及pro-caspase-1的切割，同时降低GSDMD的细胞膜定位。这种双重调控机制（抑制NLRP3组装与激活 downstream信号通路）有效阻断了IL-1β等促炎因子的级联释放。定量RT-PCR数据显示，BA处理组小鼠角膜中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达量较对照组下降达2-3个数量级，且这种抑制效应与真菌载量降低呈正相关。

临床疗效评估部分，研究采用改良的角膜炎评分系统（包含5个维度，每个维度0-4分）。结果显示，BA组（50-100μg/mL）的临床评分较对照组降低62.3%，角膜厚度测量显示水肿指数下降至0.38±0.05mm（对照组0.72±0.11mm）。特别值得注意的是，BA在抑制真菌定植（CFU计数减少78.6%）的同时，还能促进角膜上皮的再生修复，这种协同作用显著优于传统单一用药方案。

该研究首次揭示了BA在接合霉属角膜炎治疗中的双重作用机制：一方面通过破坏真菌细胞壁（β-葡聚糖合成受阻）和细胞膜（质膜磷脂过氧化增强）实现杀菌作用；另一方面通过抑制NLRP3炎症小体（p-ERK信号通路激活受抑制）和调节GSDMD蛋白切割（NT结构域寡聚化程度降低）实现抗炎效果。这种“杀菌-抗炎”双效机制有效解决了现有抗真菌药物（如唑类、棘白菌素类）的局限性——传统药物常因过度激活炎症小体导致组织损伤，而BA通过精准调控免疫应答，在清除病原体同时保护正常组织。

研究还创新性地提出了剂量依赖性疗效曲线，发现BA在50-75μg/mL区间时，抗炎活性与杀菌效能达到最佳平衡。这种浓度特性可能与BA的脂溶性-水溶性比例有关，其分子结构中的羟基与糖苷键形成特征性水脂双溶结构，确保药物能同时作用于角膜上皮细胞（水溶性成分）和真菌细胞膜（脂溶性成分）。此外，电子显微镜观察显示BA处理组真菌菌丝超微结构出现特征性空泡化，这为解析其细胞膜损伤机制提供了形态学证据。

在宿主免疫调控方面，研究首次证实BA能通过双重路径调节巨噬细胞活性：①抑制NLRP3炎症小体的激活（Western blot显示p-NLRP3水平降低至对照组的17.3%）；②阻断caspase-1的底物酶解活性（RT-qPCR检测显示pro-caspase-1表达量下降64.8%）。这种双重调控使IL-1β分泌量减少89.2%，同时促进抗炎因子IL-10的表达上调（达对照组的2.3倍）。这种免疫微环境的重构，有效防止了角膜组织过度损伤和瘢痕形成。

临床转化方面，研究建立了标准化BA制剂冻存方案（-80℃分装保存，100mg/mL原液浓度），并通过预实验验证了DMSO作为溶剂的相容性（在角膜上皮细胞中未引起DNA损伤）。动物模型构建采用球孢子接种法，成功模拟人类角膜炎的病理进程，包括上皮损伤（HE染色显示细胞层缺失）、基质水肿（Masson三色染色显示胶原纤维紊乱）和全层坏死（Draize评分达4级）等典型特征。

该研究为开发新型抗真菌角膜炎药物提供了重要理论依据。其核心创新点在于：①首次阐明BA对接合霉属的细胞壁损伤机制（β-葡聚糖合成酶活性抑制率达92.4%）；②揭示BA通过NLRP3/caspase-1-GSDMD通路调控宿主免疫反应的分子路径；③建立临床相关性小鼠模型，验证BA在治疗剂量下（100μg/mL）的角膜穿透性和生物利用度（血药浓度达峰时间tmax为2.1小时，Cmax为18.7μg/mL）。这些发现不仅为中药成分的现代药理学研究提供了新范式，更为难治性角膜炎的药物治疗开辟了新方向。

研究团队在讨论部分特别指出，BA的协同治疗效应可能源于其多靶点作用特性。实验数据显示，单独使用BA时杀菌效率（MIC90为75μg/mL）虽优于常规药物（如氟康唑MIC90为8μg/mL），但联合常规药物可产生协同效应（MIC90降至12.5μg/mL）。这种协同机制可能与BA增强常规药物的细胞膜渗透性有关，同时其抗炎特性可减轻药物副作用导致的组织损伤。

在方法学上，研究采用交叉验证设计以提高结果可靠性：①体外实验采用人角膜上皮细胞和巨噬细胞共培养模型，模拟角膜炎的免疫微环境；②体内实验使用C57BL/6小鼠构建角膜炎模型，并通过双盲法进行疗效评估；③机制研究结合组织切片（HE染色）和流式细胞术（CD68+巨噬细胞计数）进行多维度验证。这种多方法联用策略确保了研究结论的可靠性。

研究还建立了动态疗效评估体系，通过时间序列分析发现BA在治疗48小时后即显示杀菌活性（真菌载量降低至10^3 CFU/g），而抗炎效应在24小时后达到峰值（IL-6水平下降92.3%）。这种时间依赖性变化提示BA可能通过两种不同途径发挥作用：快速杀菌效应（可能涉及细胞膜损伤）和滞后性免疫调节效应（可能涉及转录因子调控）。

最后，研究团队在作者贡献声明中明确分工：Han Xiaodi负责实验设计、数据分析及论文撰写；Luan Junjie主导机制研究部分；Chen Xiangning参与数据分析和论文修订。这种精细化的分工机制保证了研究质量，同时符合学术规范。该研究已获得山东省自然科学基金（ZR2023MH068）和泰山学者计划（tsqn 201812151）资助，为后续临床试验奠定了基础。