《European Journal of Pharmacology》：Targeting Skp2 by camptothecin induces p27 accumulation and confers drug resistance in non-small cell lung cancer
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CPT通过直接结合Skp2抑制其SCF E3连接酶活性，导致p27蛋白积累；但Skp2过表达显著增强NSCLC细胞对CPT的敏感性，表现为DNA损伤和凋亡增强，提示Skp2可作为CPT疗效的预测生物标志物。
Ming Hong|徐子伟|吴培恩|张继坤|邢尚平|刘永强
中山人民医院高级诊断与临床医学部，中国中山528400
摘要
Skp2通过促进依赖泛素的周期依赖性激酶抑制剂p27的降解，在调节细胞周期进展中起着关键作用。多项研究表明，Skp2的过表达与癌症化疗耐药性有关；然而，它对非小细胞肺癌（NSCLC）中对拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（CPT）的敏感性影响尚不清楚。在本研究中，我们发现CPT可以显著诱导p27的积累。机制上，CPT可以直接与Skp2蛋白结合并抑制Skp2-SCF E3泛素连接酶的活性，这通过CPT处理后p27泛素化水平下降得到证实。在NSCLC细胞中异位表达Skp2会消除CPT诱导的p27积累。值得注意的是，Skp2的过表达显著增加了NSCLC细胞中的CPT诱导的DNA损伤和凋亡，而使用SZL P1-41药理学抑制Skp2可部分逆转CPT的细胞毒性。过表达Skp2的A549细胞异种移植体对CPT的敏感性高于表达空载体的A549细胞异种移植体；高Skp2水平的肿瘤在CPT处理后表现出较低的p27表达和更严重的DNA损伤。总体而言，我们的研究表明CPT通过靶向Skp2来诱导p27的积累，而Skp2的过表达可以调节其脱靶效应并提高NSCLC对CPT的敏感性，这支持将Skp2作为基于CPT的疗法的预测生物标志物的潜力。
引言
尽管在癌症治疗方面取得了实质性进展，化疗仍然是非小细胞肺癌（NSCLC）患者的主要治疗手段（Chaft等人，2021年）。喜树碱（CPT）及其衍生物作为拓扑异构酶抑制剂已被广泛用于临床癌症治疗，然而，耐药性的频繁出现及其潜在机制尚未完全明确，限制了其临床疗效（Beretta等人，2013年）。癌基因的过表达通常与癌细胞的凋亡抵抗相关（Neophytou等人，2021年）。致癌F-box蛋白Skp2是SCF（Skp1–Cullin1–F-box蛋白）E3泛素连接酶的组成部分，已被证实与多种癌症类型的化疗耐药性和不良临床结果有关（Wu等人，2021年）。
SCF E3连接酶是一个由Skp1、Rbx1、cullin1和F-box蛋白组成的蛋白质复合物，其中F-box蛋白赋予底物特异性。Skp2-SCF E3连接酶通过诱导肿瘤抑制蛋白的蛋白酶体降解以及介导依赖泛素的致癌蛋白激活来发挥致癌作用（Cai等人，2020年）。Skp2诱导细胞周期检查点蛋白p27的泛素化降解，从而导致细胞周期进展和肿瘤发生（Bornstein等人，2003年；Carrano等人，1999年）。Skp2还通过促进Akt的K63连接多聚泛素化和EMT调节因子Twist的激活来促进癌症转移（Ruan等人，2017年）。这些研究表明，Skp2在癌症中的过表达在癌症进展中起着关键作用。
迄今为止，越来越多的研究表明Skp2的过表达与化疗耐药性相关，而抑制Skp2可以增强肿瘤细胞对传统化疗药物的敏感性。例如，Skp2介导的Akt泛素化可导致其线粒体定位和内在的凋亡抵抗，这种机制被认为与鼻咽癌的顺铂耐药性有关（Yu等人，2019年）。在NSCLC中，Skp2的上调已被证明会下调坏死效应蛋白MLKL，从而促进顺铂耐药性（Zhou等人，2023年）。使用化合物#25（SZL P1-41）药理学抑制Skp2已被证明可以增强前列腺癌细胞中对多柔比星和环磷酰胺的细胞毒性（Chan等人，2013年），并增强急性淋巴细胞白血病细胞中对多柔比星的凋亡作用（Shabestari等人，2022年）。然而，经典的Skp2-p27轴在化疗耐药性中的作用仍不清楚。一项研究表明，NSCLC中p27的阳性表达并不能预测辅助顺铂化疗的益处，而p27阴性的患者在接受顺铂化疗后总体生存率有所改善，这种效果可能归因于p27介导的G1期停滞和抗凋亡保护（Azzoli等人，2008年）。因此，进一步研究Skp2-p27信号通路与化疗敏感性之间的关联是值得的。
在我们之前的研究中，通过对植物化学库的虚拟筛选，我们发现CPT是一种潜在的Skp2结合化合物（He等人，2021年）。因此，我们探讨了Skp2表达是否调节NSCLC对CPT的敏感性。在这里，我们确认CPT确实靶向Skp2，导致p27蛋白的积累。矛盾的是，Skp2的过表达在体外和体内都显著增强了NSCLC细胞对CPT的敏感性。这些结果表明，Skp2的过表达可能作为对基于CPT的疗法有良好反应的预测生物标志物。
试剂和抗体
CPT和SZL P1-41购自MedChemExpress（美国新泽西州）。针对Skp2、p27和GAPDH的一抗来自Proteintech Group（美国伊利诺伊州）；针对PARP和γ-H2AX的抗体购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）；针对Flag、HA和MYC标签的抗体购自Abbkine（中国武汉）。所有二抗（HRP标记的抗小鼠IgG和抗兔IgG）均来自Proteintech。
细胞培养
293T细胞和人NSCLC细胞系A549
CPT显著诱导p27蛋白积累
基于我们之前的高通量虚拟筛选数据，表明CPT可能结合Skp2（He等人，2021年），我们旨在研究CPT对Skp2及其已知底物p27的影响。为了减轻CPT对NSCLC细胞的直接细胞毒性，我们首先进行了细胞活力测定，并选择了低于IC50值的CPT浓度用于后续实验（图1A和B）。有趣的是，CPT在12小时和24小时时均显著增加了NSCLC细胞中的p27表达。
讨论
化疗耐药性仍然是有效癌症治疗的主要障碍，最近的研究主要集中在提高药物递送效率和减少相关毒性的方法上。CPT及其衍生物具有显著的抗癌效果，被广泛用于治疗包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和胃癌在内的实体瘤（Hevener等人，2018年）。然而，某些肿瘤类型对CPT产生耐药性，并且患者之间的耐药性存在差异，这需要进一步研究其潜在机制。
结论
总之，我们的研究发现CPT直接靶向Skp2，抑制Skp2-SCF E3连接酶并促进p27的积累；而Skp2的过表达则抵消了CPT的抑制作用，恢复了p27的降解并增强了CPT诱导的NSCLC细胞的DNA损伤和凋亡。因此，Skp2的过表达使NSCLC细胞对CPT更敏感，而Skp2的抑制则降低了这种敏感性。这项工作确定了一种提高CPT及其疗效的治疗方案。
CRediT作者贡献声明
徐子伟：软件、方法学、数据分析。刘永强：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、监督、项目管理、资金获取、数据分析、概念构思。邢尚平：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。张继坤：验证、数据分析。吴培恩：方法学、数据分析、概念构思。洪明：撰写 – 初稿、可视化、方法学
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
数据获取
支持本研究结果的数据可在合理请求下从通讯作者处获得。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：无
致谢
本工作得到了广东省医学科学研究基金会（编号A2024431）、广西壮族自治区自然科学基金（编号2023GXNSFBA026237）、国家自然科学基金（编号82460718）以及广西壮族自治区第一批青年人才项目（编号DC2400003575）的支持。
