全外显子测序和单细胞DNA测序在评估急性髓系白血病中的克隆异质性和进化中的作用

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Whole Exome Sequencing and Single-Cell DNA Sequencing for Assessment of Clonal Heterogeneity and Evolution in Acute Myeloid Leukemia

本研究对比了全外显子组测序（WES）和单细胞DNA测序（scDNA-seq）在急性髓性白血病（AML）克隆异质性和进化分析中的应用。WES检测到更多突变和克隆，但可能遗漏低频变异；scDNA-seq能精准识别稀有克隆和拷贝数变化，但受限于目标面板和扩增偏倚。两者均能识别主要克隆群，但scDNA-seq在低频变异检测上更优，WES在广泛突变分析上更具优势。研究提出结合两种技术可提高AML进化分析准确性。

　　
这项研究由芬兰赫尔辛基大学医院的学者团队开展，旨在评估全外显子测序（WES）和单细胞DNA测序（scDNA-seq）在急性髓性白血病（AML）克隆异质性和进化分析中的效能与局限性。研究聚焦于6名AML患者的样本，包括4名患者的纵向样本（治疗前与复发后），通过对比两种技术的结果，揭示了其在临床应用中的互补性。

### 研究背景与意义
AML的复发机制与克隆异质性密切相关。现有研究表明，AML的复发可能源于治疗敏感克隆的适应性进化或耐药亚克隆的扩增。尽管传统基因组学技术（如WES）已用于风险分层和监测治疗响应，但其在捕捉低频克隆和动态进化方面的不足逐渐显现。单细胞测序（scDNA-seq）凭借对稀有克隆的高分辨率检测，成为新兴技术，但其临床实用性仍受限于成本、技术复杂性和数据解读难度。本研究通过对比两种技术的全面数据，为临床选择提供技术路线依据。

### 方法学特点
研究采用混合测序策略：WES覆盖全外显子（41 Mb），通过变异检测和CopyCat工具分析基因拷贝数，结合PhyloWGS重建克隆进化树；scDNA-seq则基于Tapestri平台靶向45个AML相关基因（65 kb），通过Mosaic和COMPASS工具解析单细胞克隆谱及CNV状态。关键创新点包括：
1. **纵向样本分析**：对4名患者进行治疗前（诊断）与复发后样本的对比研究，捕捉克隆动态变化。
2. **多维度数据整合**：WES提供全局变异谱和CNV，scDNA-seq专注靶向基因的细胞级变异与CNV分辨率。
3. **标准化比对流程**：通过仅保留两种技术共检测的变异和克隆进行相关性分析，减少技术偏差。

### 核心发现
1. **变异检测差异**：
- WES检测到234个总突变（180基因），scDNA-seq识别1024个事件中筛选出的33个（12基因）。WES因覆盖更广，检测到更多低频突变（如ETV6、PHF6、IDH2），但漏检了ASXL1等临床相关突变。
- scDNA-seq在检测极低丰度突变（如1.26%的IDH2突变）时更具优势，但受限于靶向面板，对非目标基因变异检测不足。

2. **克隆组成与进化分析**：
- WES平均识别3.5个克隆/样本，scDNA-seq为2.5个，但scDNA-seq能更精准追踪稀有克隆的演化轨迹。例如，患者FPM_AML_015的PHF6突变亚克隆从诊断时的9细胞扩增至复发时的40%。
- 两种技术均能识别主要驱动基因（如DNMT3A、JAK2、FLT3-ITD），但scDNA-seq在CNV解析（如RUNX1 LOH、BCOR重排）和亚克隆层次变异检测上表现更优。

3. **临床风险分层的差异**：
- WES根据全基因组变异和CNV将4/6患者归为高危组（如ASXL1突变、复杂染色体异常），scDNA-seq因部分基因遗漏（如FLT3-ITD未检出）导致2例临床高危患者被误判为低风险。
- 患者FPM_AML_015因scDNA-seq未检测到FLT3-ITD，其风险分层从WES的中间风险变为scDNA-seq的 favorable，凸显靶向面板的临床适用性需结合 bulk 数据优化。

### 技术瓶颈与改进方向
1. **WES局限性**：
- 低频突变（VAF<5%）和CNV检测灵敏度不足，导致稀有克隆（<1%）和CNV异质（如NF1 LOH）易被漏检。
- 计算工具（如PhyloWGS）依赖预设的变异-克隆映射关系，可能合并邻近亚克隆。

2. **scDNA-seq挑战**：
- 靶向面板设计需依赖前期bulk测序结果，否则难以捕获关键驱动基因（如ASXL1突变被过滤）。
- 染色体扩增（如MPL1）和LOH（如RUNX1）的检测存在技术偏差，可能因测序深度和扩增效率差异导致结果不一致。
- 最低阈值设定（如5% VAF）限制了罕见亚克隆的识别，需结合临床意义动态调整。

### 临床转化启示
1. **互补技术整合**：
- WES适用于大队列的群体特征分析（如驱动基因频率统计），scDNA-seq更适合个体化监测（如MRD检测）。
- 研究建议采用"bulk WES + targeted scDNA-seq"组合：先用WES筛选关键基因面板，再用scDNA-seq追踪低频变异和亚克隆演化。

2. **靶向面板优化**：
- 基于WES发现的临床相关突变（如ASXL1、FLT3-ITD），可将靶向面板从45基因扩展至80-100基因，平衡成本与信息量。
- 引入"白名单"机制：将WES确认的驱动基因纳入scDNA-seq分析，可提升罕见驱动突变的检出率。

3. **进化树重建标准化**：
- 开发兼容两种数据源的算法（如将WES的CNV数据映射到scDNA-seq的靶向区域），解决当前PhyloWGS仅支持bulk数据的问题。
- 建立动态阈值系统：根据治疗阶段和临床需求调整变异丰度阈值（如治疗初期关注>1%突变，复发期放宽至0.5%）。

### 局限性与未来方向
1. **样本量限制**：仅6例患者（其中4例纵向数据）导致结论普适性存疑，需扩大队列（如50+患者）验证关键发现。
2. **技术偏倚未解**：scDNA-seq的ADO率（12.6%）和WES的假阴性率（如PHF6突变因p值0.053被排除）仍需通过标准化流程优化。
3. **纵向追踪深度**：现有研究仅覆盖2个时间点，建议设计5年随访研究，追踪亚克隆克隆的演化轨迹（如ETV6突变克隆在化疗中的动态变化）。

### 结论
研究证实：WES在全面变异谱和CNV检测上具有优势，适合临床风险分层和药物靶点筛选；scDNA-seq在单细胞克隆分辨率和低频变异捕获方面更优，但需结合bulk数据优化靶向面板。临床实践中应建立"测序策略-数据分析-临床解读"的闭环体系，例如：
- **诊断阶段**：WES结合靶向scDNA-seq（覆盖ELN指南关键基因）进行初始风险分层
- **治疗监测**：scDNA-seq动态追踪治疗敏感克隆（如DNMT3A突变亚克隆）的VAF变化
- **复发预警**：结合两种技术检测CNV异质性和驱动突变克隆的频率波动

该研究为精准医疗提供了技术路线参考，后续需通过多中心大样本研究验证其临床转化价值。