《Biochemical Pharmacology》：Glucocorticoid impairs angiogenesis-dependent osteogenesis by downregulating EphB4 in endothelial cells
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糖皮质激素性骨质疏松症（GIOP）的病理机制涉及EphB4表达下降和Wnt/β-catenin通路抑制，导致内皮细胞衰老和血管生成-骨形成耦合失调。
任庆华|荣星|刘婷|张志超|张卫东|刘宏瑞|关世兵|李敏琦
山东大学齐鲁医学院口腔科学与医院骨代谢科，山东省口腔组织再生重点实验室，山东省牙科材料与口腔组织再生工程技术研究中心，济南，中国
摘要
长期或高剂量糖皮质激素（GC）暴露会导致快速骨质流失和微观结构恶化，最终引发糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP）。尽管GIOP的进展与H型血管功能受损密切相关，但其潜在机制仍不完全清楚。利用地塞米松（DEX）诱导的GIOP小鼠模型，我们观察到H型血管和Ephrin B4受体（EphB4）表达的同时减少。将骨髓间充质干细胞（BMSCs）与过表达EphB4的内皮细胞（ECs）共培养，证实内皮细胞中的EphB4是依赖血管生成的骨形成的关键调节因子，而这一过程受到DEX介导的EphB4下调的干扰。具体而言，DEX诱导的EphB4下调导致ECs发生细胞衰老，由此产生的衰老相关分泌表型（SASP）可能进一步损害BMSC的骨形成能力。我们还观察到，ECs与BMSCs之间EphB4-EphrinB2的相互作用减弱可能进一步加剧骨形成障碍。Wnt/β-连环蛋白通路被确定为DEX抑制ECs中EphB4表达的关键介质。总体而言，这些发现揭示了一种先前未被认识的EphB4介导的GIOP发病机制，并为针对血管生成-骨形成耦合的潜在治疗策略提供了机制上的见解。
引言
糖皮质激素（GC）是一类具有强免疫调节作用的类固醇激素，仍然是许多炎症性和自身免疫性疾病的主要治疗手段[1,2]。然而，长期或高剂量使用GC会带来不良反应，30-50%的接受治疗者会出现骨质流失和骨折，从而导致糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIOP）[3,4]。作为最常见的继发性骨质疏松症类型，GIOP的特点是骨折风险提前且显著增加，通常在骨密度显著下降之前就已出现[5]。要解决这一重大的临床和经济负担，需要更深入地了解GIOP的发病机制，以便开发有效的靶向干预措施。
GIOP的发病机制是多因素的[6]。过量或长期使用GC会通过同时抑制成骨细胞介导的骨形成和促进破骨细胞介导的骨吸收来破坏骨重塑，从而使骨平衡向吸收侧倾斜[7]。新证据表明，GC通过诱导H型血管的退化来损害依赖血管生成的骨形成——H型血管是一种对骨形成-血管生成耦合至关重要的特殊毛细血管亚型[8,9]。GC通过下调血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）、血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等血管生成-骨形成相关因子，从而破坏这一关键耦合，最终影响H型血管的功能[10,11]。尽管有这些发现，GC如何损害血管内皮细胞（ECs）的机制仍不充分明确，这突显了进一步进行机制研究的必要性。
Ephrin受体是最大的受体酪氨酸激酶家族，对调节内皮细胞的关键功能（包括增殖、迁移和凋亡）起着关键作用[12]。在这个家族中，Ephrin B4受体（EphB4）是内皮功能的关键调节因子。EphB4在胚胎发生过程中选择性表达于静脉内皮细胞中，对其血管成熟至关重要，因为其缺失会导致胚胎死亡[13,14]。我们之前的研究表明，成骨细胞中的EphB4表达可以抑制破骨细胞的分化，这突显了其在绝经后骨质疏松症（PMOP）中的治疗意义[15,16]。尽管如此，EphB4是否以及如何参与GC诱导的GIOP中的血管生成-骨形成障碍仍不清楚，这是本研究的重点问题。
最近的研究表明，GC通过下调血管生成素/plexin-B2介导的核糖体生物合成途径，在骨干骺端诱导H型内皮细胞衰老，从而损害依赖血管生成的骨形成[17]。鉴于EphB4对内皮细胞稳态的重要性，以及其缺乏会通过线粒体功能障碍促进内皮细胞衰老[18]，我们假设GC通过下调EphB4来诱导内皮细胞过早衰老，从而导致GIOP。此外，由于ECs上的EphB4与成骨细胞上的EphrinB2之间存在双向信号传导以支持成骨细胞存活[19]，我们推测GC诱导的EphB4下调可能还会通过破坏这种直接的细胞间相互作用来损害骨形成。
Wnt/β-连环蛋白通路是成骨细胞分化的经典调节因子，已被认为是GIOP发病机制的关键介质[7]。然而，其在ECs中的具体功能仍不明确。基于Wnt/β-连环蛋白信号传导在其他生物系统中促进EphB4上调的证据[20]，我们研究了抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导是否介导GC诱导的ECs中EphB4下调的假设。
本研究表明，GC通过抑制Wnt/β-连环蛋白通路来抑制ECs中的EphB4表达，触发一系列细胞衰老反应，最终破坏GIOP中的依赖血管生成的骨形成。衰老的内皮细胞可能通过分泌衰老相关分泌表型（SASP）因子来损害骨形成。此外，我们的数据表明，EphB4-EphrinB2信号传导的减弱可能进一步损害骨形成能力。总体而言，这些发现揭示了一种新的EphB4介导的GIOP发病机制，为针对这一途径作为潜在治疗策略提供了机制依据。
GIOP模型的建立与收集
所有动物实验均获得了山东大学口腔医学院动物伦理委员会的批准（批准编号：202503039），并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的实验动物护理和使用指南进行。实验所用8周大的雄性BALB/c小鼠由济南鹏月实验动物繁殖有限公司提供，饲养在标准化的12小时光照/黑暗周期环境中，温度保持恒定（22±2℃），湿度为50±5%。
DEX抑制小鼠的依赖血管生成的骨形成
通过给予DEX建立了GIOP小鼠模型。H&E染色和μCT组织学分析显示，对照组小鼠的胫骨中骨小梁网络组织良好、密集且相互连接。相比之下，DEX处理的小鼠的松质骨微结构严重退化，表现为骨小梁稀疏、破碎且不连续（图1A, B）。与这种结构退化一致，我们观察到干骺端H型血管显著减少。
讨论
血管系统是维持骨稳态的关键调节网络。在这一网络中，H型血管——一种以其高水平的Emcn和CD31共表达为特征的特殊内皮亚型——已被确定为血管生成-骨形成的关键调节因子[9]。长期使用GC会显著减少H型血管的数量，这是GIOP中观察到的骨质流失的关键病理特征[32]。
作者贡献声明
任庆华：撰写初稿、数据可视化、方法验证、数据管理、概念构建。荣星：数据可视化、方法设计、数据管理。刘婷：软件操作、方法设计、数据管理。张志超：方法设计、实验研究、数据分析。张卫东：方法设计、实验研究、数据分析。刘宏瑞：资源提供、项目管理、资金争取。关世兵：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调。李敏琦：撰写、审稿与
利益冲突声明
作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。
致谢
本研究得到了山东省泰山学者计划（编号：tstp20221160）对李敏的支持，山东省“泰山青年学者”建设工程专项基金（编号：tsqn202103177）以及山东省自然科学基金（编号：ZR202210210042）对刘宏瑞的支持。感谢山东大学转化医学核心设施在咨询和仪器提供方面的支持。
图5A中的插图和图形摘要由
