G蛋白亚型的偏好决定了帕罗西汀对非恶性乳腺上皮细胞中血清素受体反应的增强作用

《Biochemical Pharmacology》：G protein subtype preference dictates paroxetine-enhanced serotonin receptor response in non-malignant breast epithelial cells

血清素（5-HT）受体激活通过G蛋白信号通路抑制非恶性乳腺细胞增殖，帕罗西汀通过阻断5-HT重摄取影响受体介导的细胞周期调控和神经传递相关基因表达，揭示G蛋白亚型偏好性调控机制。

　　

Máté Lengyel|Péter árkosy|Iván P. Uray

匈牙利德布勒森大学医学院生物化学与分子生物学系

摘要

血清素（5-HT）在塑造乳腺组织形态以及调节生长、泌乳和退化过程中起着关键作用。血清素再摄取抑制剂（SSRIs）能将5-HT保留在细胞膜外，但它们通过改变细胞增殖来影响乳腺癌风险的作用尚不清楚。我们利用转录组学和信号传导分析方法，以及对受体选择性配体的系统筛选，评估了5-HT受体激活对非恶性乳腺细胞生长的影响。

帕罗西汀降低了永生化原代乳腺上皮细胞（HME-hTert）中的5-HT水平，减少了自由氧基的形成，并抑制了细胞的迁移和增殖。因此，在帕罗西汀处理过的细胞的转录组谱中，与细胞周期和DNA损伤修复相关的通路表达较低。然而，与神经传导和GPCR信号传导相关的基因表达增强，这表明5-HT受体激活有所增加。由于5-HT能同时诱导cAMP和肌醇三磷酸（IP3）的水平，我们使用受体选择性激动剂和拮抗剂来解析各个受体的作用。所有G_α蛋白亚型的5-HT受体都存在并具有功能性。G_S偶联的5-HT₇受体以及G_i和G_q偶联的5-HT_1D和5-HT_2B受体的拮抗剂通常能抑制细胞增殖。G_S偶联的5-HT₇受体抑制剂、蛋白激酶A抑制剂以及G_i和G_q偶联受体的激动剂可以逆转帕罗西汀引起的生长抑制作用。

这些相互作用表明，非恶性乳腺细胞对5-HT的抗增殖反应与其所结合的G蛋白亚型有关。重新利用受体亚型选择性药物和SSRIs及其理想组合，为降低癌症风险提供了新的机会。

引言

血清素（5-HT）作为一种神经单胺类神经递质，调节情绪、记忆、昼夜节律和行为，以及呼吸和体温调节机制[1,2]。然而，越来越多的证据表明，5-HT在神经系统外也具有重要的旁分泌效应[3, [4], [5]]。在乳腺的生理调节中，血清素能促进泌乳、启动乳腺退化过程，并促进骨骼中钙的释放[6,7]。神经内分泌稳态的紊乱或微生物群失衡会对肿瘤发生和生长产生显著但尚不明确的影响[8,9]。研究显示，晚期乳腺肿瘤患者的血清素水平升高[10]，且5-HT常被视为乳腺癌的预测标志物[11,12]。

细胞外的血清素信号通过13种代谢型5-HT受体（5-HT_1-7）和配体门控离子通道5-HT₃进行传递[13]。由于所有5-HT受体都使用相同的配体，而不同组织表达的这些受体数量和组合各不相同，因此明确每种受体的具体作用途径和生理功能一直是一个挑战。在正常细胞和癌细胞中，已经研究了多种5-HT受体激活后的信号传导事件，这些事件与细胞增殖和凋亡的调控有关[3,14,15]。相反，预计会出现新的或重新开发的通过5-HT受体起作用的治疗药物[16], [17], [18]]。

除了通过TPH1酶合成5-HT外，乳腺上皮细胞还能通过钠-血清素同向转运蛋白SERT（SLC6A4）从细胞外空间获取血清素[19]。在突触间隙中，血清素再摄取抑制剂（SSRIs）抑制5-HT的摄取，从而增强和延长突触后血清素的信号传导。然而，在上皮细胞中，SSRIs对5-HT受体依赖性反应的影响尚未明确。我们假设SSRIs可能类似于在神经元中一样增强乳腺上皮细胞中的受体依赖性信号传导，而具体反应类型将取决于受影响的受体和第二信使。

在本研究中，我们探讨了SSRI帕罗西汀对5-HT分布和信号传导的影响。我们确定了参与其中的血清素受体及其调节下游信号传导、细胞增殖和运动的G蛋白。利用受体亚型特异性激动剂和拮抗剂，我们发现了抑制细胞增殖的途径。结果表明，G_sα受体的激活以及通过G_i和G_q受体作用的拮抗剂能够抑制细胞增殖，而G_q和G_i激动剂的影响较小。我们的数据表明，G蛋白亚型的偏好是乳腺细胞对5-HT反应的关键决定因素。

实验方法

细胞、基于显微镜的2D增殖实验和化合物筛选

永生化正常乳腺上皮细胞（HME-hTert）在添加了生长因子SingleQuots（Lonza, Basel, CH）的乳腺上皮基底培养基（MEBM）中培养。实验前通过深度测序确认细胞系的真实性，并定期使用Promokine PCR检测方法进行支原体检测。整个研究过程中，仅使用传代次数小于15的HME-hTERT细胞，以确保实验结果的一致性。

5-HT和帕罗西汀抑制永生化乳腺上皮细胞的增殖

为了评估血清素刺激对乳腺上皮细胞增殖的影响，我们使用选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRIs）西酞普兰、舍曲林和帕罗西汀处理HME-hTert细胞，进行了2D增殖实验。实验结果表明，帕罗西汀在浓度达到或超过1 μM时显著抑制了细胞增殖（图1A）。此外，5-HT本身也以剂量依赖的方式抑制了细胞增殖。

讨论

越来越多的证据表明，在恶性转化过程中，单胺类神经递质信号传导系统在多个层面上发生了改变[8,21]。对于血清素而言，这种变化包括其生物合成和组织水平的改变以及5-HT受体表达谱的变化，并导致细胞代谢向糖酵解途径转变[11,14,22]。通过抑制表达SERT转运蛋白的细胞对血清素的摄取，SSRIs调节了细胞外空间中的5-HT水平。

出版同意

所有作者都对稿件的先前版本进行了审阅，并批准了最终版本。所有作者均同意发表该稿件。

作者贡献声明

Máté Lengyel：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析。Péter árkosy：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金申请。Iván P. Uray：

资金支持

这些研究得到了匈牙利国家研究、发展与创新办公室（K129218项目）对IPU的支持。研究还得到了德布勒森大学科学研究资助基金（DETKA）、UD出版支持计划以及UD临床中心（IPU, Pá）的协助。此外，还得到了匈牙利创新与技术部úNKP-23–3 II新国家卓越计划的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Attila Sz?ll?si博士在使用HTRF读数器进行IP1水平测定方面提供的帮助，以及Szilárd Póliska博士在下一代测序技术上的技术支持。图表的制作由BioRender.com完成。