靶向TET3通过破坏Otx2超级增强子低甲基化抑制第3组髓母细胞瘤干性及进展

《Cell Reports Medicine》：Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer

本研究针对第3组髓母细胞瘤(G3-MB)治疗难题，发现TET3介导的Otx2超级增强子低甲基化是维持肿瘤干性的关键机制。通过脂质纳米颗粒递送TET3抑制剂或siRNA，在患者来源异种移植模型中显著抑制肿瘤生长，为G3-MB提供了新的表观遗传治疗策略。

　　

在儿童脑肿瘤中，髓母细胞瘤(Medulloblastoma, MB)约占25%，其中第3组髓母细胞瘤(Group 3 Medulloblastoma, G3-MB)因具有强干性和治疗抵抗性，患者5年生存率不足50%，成为临床治疗的重大挑战。当前手术联合放化疗的治疗方案往往导致患儿神经系统不可逆损伤，而针对WNT和SHH亚组的靶向疗法对G3-MB效果有限，这主要源于该亚组缺乏明确的驱动突变，其发病机制主要与表观遗传调控异常相关。

近年来研究发现，超级增强子(Super-Enhancer, SE)的异常活化在维持肿瘤细胞干性中发挥关键作用。Orthodenticle homeobox 2 (OTX2)作为G3-MB的主要调控因子，能够促进肿瘤细胞自我更新并阻碍分化，但其表达的具体表观遗传调控机制尚不明确。尤其值得注意的是，DNA去甲基化酶TET家族蛋白与活性增强子区域的正相关性已得到证实，然而TET酶是否通过调控Otx2超级增强子的甲基化状态来影响G3-MB的进展，仍有待深入探索。

针对这一科学问题，陈宣等人发表在《Cell Reports Medicine》上的研究，通过整合多组学分析和技术手段，系统揭示了TET3介导的Otx2超级增强子低甲基化在G3-MB中的关键作用，并开发了基于脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle, LNP)的靶向治疗策略。

研究团队主要运用了全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)分析189例MB样本的DNA甲基化谱；单核RNA测序(snRNA-seq)和单核ATAC测序(snATAC-seq)解析肿瘤细胞异质性；染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和CUT&Tag技术检测蛋白质-DNA相互作用；患者来源异种移植(PDX)模型评估治疗效果；以及LNP递送系统进行体内靶向治疗。样本来源于北京天坛医院等临床中心的治疗初治MB患者组织。

整合表观基因组和转录组分析重现MB亚组

研究人员首先通过高分辨率WGBS对189例初治MB样本进行分析，成功区分出MB的四个分子亚组。研究发现，超级增强子区域在四个亚组中均呈现出丰富的差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMRs)，且这些seDMRs与靶基因表达呈显著负相关，表明超级增强子DNA甲基化在MB特异性基因表达调控中起重要作用。

SE DNA低甲基化与MB肿瘤发生相关

进一步分析显示，低甲基化的功能性超级增强子差异甲基化区域(hypo-F-seDMRs)靶向的基因显著富集于各亚组起源的小脑祖细胞中。特别是在G3-MB中，这些靶基因在与肿瘤自我更新能力相关的通路中富集，表明异常增强子甲基化能够维持MB祖细胞样转录特征。

祖细胞样肿瘤细胞特异性SE低甲基化增加G3-MB中的染色质可及性

通过单核多组学分析，研究人员在G3-MB中鉴定出三种主要的肿瘤细胞群体：祖细胞样(prog.like)、周期型(cycling)和分化神经元样(diff.like)肿瘤细胞。研究发现，大多数(63%)祖细胞样肿瘤细胞的特异性可及性峰值位于低甲基化SEs内，而分化程度较高的肿瘤细胞中仅有少量(22%)峰值位于低甲基化SEs。特别值得注意的是，Otx2超级增强子低甲基化与肿瘤发生早期阶段染色质可及性(Chromatin Accessibility, CA)增加密切相关。

Otx2枢纽增强子的低甲基化作为预后指标

研究人员通过enhancer网络分析(eNET算法)发现，Otx2的"枢纽增强子"(hub enhancer)E33在G3-MB中呈现明显的低甲基化状态，且与Otx2表达密切相关。临床分析表明，E33低甲基化与G3-MB患者不良预后显著相关，多因素分析确认其可作为G3/4-MB患者的独立预后指标。

OTX2前馈自动调节促进G3-MB进展

机制上，ChIP-seq分析显示OTX2在其超级增强子区域有显著结合，Hi-C数据证实E33与Otx2启动子存在空间邻近。报告基因实验表明，OTX2作为反式作用因子，通过与其超级增强子E33结合形成正反馈自动调节环路，促进自身表达。功能实验证实，破坏E33的OTX2结合位点可显著抑制肿瘤细胞增殖、侵袭并促进分化。

OTX2招募的TET3对Otx2 SEs进行去甲基化

研究人员发现OTX2结合位点与低甲基化区域显著共定位。在G3-MB中，TET3而非DNMT(DNA甲基转移酶)的表达模式与增强子低甲基化相关。实验证明，TET3敲低可导致Otx2超级增强子甲基化水平增加和Otx2表达下降。CUT&Tag-seq和Co-IP实验证实OTX2与TET3存在物理相互作用，且约半数TET3结合位点与OTX2结合位点重叠，表明OTX2可招募TET3至特定基因组位点。

体内下调TET3可减弱G3-MB进展

为验证治疗潜力，研究团队开发了LNP递送系统，用于装载TET3抑制剂Bobcat339或siTET3。体内实验表明，脑室内给予LNP@Bobcat339或LNP@siTET3可显著抑制G3-MB异种移植瘤的生长，延长小鼠生存期，并降低肿瘤细胞增殖标志物Ki-67和侵袭标志物MMP9的表达。

进一步机制探索发现，TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1)信号可通过Smad复合物上调TET3表达，从而促进Otx2表达。TET3敲低可抑制TGF-β1诱导的肿瘤细胞增殖和侵袭，表明TGF-β1/Smads/TET3轴在G3-MB进展中发挥重要作用。

本研究首次揭示了TET3介导的Otx2超级增强子低甲基化在G3-MB中的关键作用，阐明了OTX2/TET3正反馈环路维持肿瘤干性的分子机制。更重要的是，研究团队开发的LNP递送TET3靶向治疗策略，为G3-MB提供了潜在的低毒性表观遗传治疗新途径。

研究的创新性在于：首先，通过高分辨率WGBS揭示了超级增强子DNA甲基化在MB亚型特异性调控中的作用；其次，发现OTX2可特异性招募TET3至其超级增强子区域，实现位点特异性去甲基化；最后，成功将基础研究发现转化为治疗策略，利用纳米技术实现中枢神经系统靶向给药。

尽管该研究存在样本量有限、Bobcat339可能存在的脱靶效应等局限性，但其提出的TET3-Otx2 SE轴为G3-MB治疗提供了新的靶点，LNP递送系统也为其他脑部疾病的靶向治疗提供了借鉴。未来研究可进一步优化纳米颗粒的靶向性，探索联合治疗策略，推动这一发现向临床转化。