基于全基因组测序的幽门螺杆菌临床分离株耐药机制研究揭示克拉霉素和左氧氟沙星外其他抗生素耐药遗传基础尚不明确

《iScience》：Whole genome sequence analysis of Helicobacter pylori isolates reveals incomplete characterization of antimicrobial resistance mechanisms

本研究针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)对常用抗生素耐药机制遗传基础不清的问题，通过对530株临床分离株进行全基因组测序(WGS)和表型药敏试验，发现除克拉霉素(与23S rRNA基因突变相关)和左氧氟沙星(与gyrA突变相关)外，阿莫西林、甲硝唑和利福平的耐药表型与已知基因突变缺乏明确相关性，揭示了当前基因型耐药检测技术的局限性，为开发更精准的分子诊断方法提供了重要依据。

　　

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种在全球范围内引起慢性细菌感染最常见的病原体之一，它与慢性胃炎、消化性溃疡病、胃腺癌和胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤等严重疾病密切相关。当前指南建议对幽门螺杆菌阳性者无论有无症状均应进行治疗。传统上，幽门螺杆菌的治疗多为经验性用药，涉及多药联合方案。不幸的是，幽门螺杆菌的抗菌药物耐药性已成为一个全球性的挑战。当存在耐药风险时，药敏试验(AST)对于其他细菌感染是常规进行的，并且有建议指出，即使在初治病例中，也应对幽门螺杆菌进行药敏试验，因为基于药敏结果指导的三联疗法比经验性三联疗法具有更好的临床效果。

在幽门螺杆菌中，克拉霉素耐药性广泛存在，并且是其特征最清楚的耐药机制。克拉霉素耐药通常是由于23S核糖体RNA(rRNA)基因特定位点的单核苷酸多态性(SNPs)所致。同样，对氟喹诺酮类药物左氧氟沙星的耐药性也研究得比较清楚，主要与GyrA蛋白氨基酸残基87或91的突变相关。然而，对于其他抗生素，包括阿莫西林、甲硝唑、利福平和四环素的耐药机制，其遗传特征远不如克拉霉素和左氧氟沙星耐药机制那样明确。这限制了针对这些抗生素耐药性的基因型检测方法（包括直接检测临床标本）的发展和临床应用。

进行表型药敏试验需要内镜检查获取标本进行培养，从组织中分离出微生物，然后对分离出的微生物进行表型药敏试验。这个过程复杂，因为内镜检查并非普遍可用或在初治病例中并非必需，培养仅在有限的环境中可行，并且由于幽门螺杆菌的苛养性，其表型药敏试验具有挑战性。近年来，已经描述了幽门螺杆菌耐药性基因型检测方法，并且证明适用于粪便或胃标本（甚至是福尔马林固定石蜡包埋组织）。然而，除了克拉霉素和左氧氟沙星之外，幽门螺杆菌对表型耐药性的基因型特征仍然知之甚少。因此，幽门螺杆菌中针对其他药物的分子抗菌药物敏感性评估的临床效用有限。

为了更好地理清幽门螺杆菌中基因型与表型之间的关联，研究人员开展了一项深入研究。该研究对幽门螺杆菌分离株进行了表型药敏试验和全基因组测序(WGS)。利用全基因组测序数据，研究人员创建了表型与基因型谱之间的全基因组关联，并重点分析了据报告与阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑和利福平耐药相关的基因和单核苷酸多态性。该研究旨在填补当前知识的空白，评估利用现有遗传信息预测临床相关抗生素耐药性的可行性。

本研究主要运用了几项关键技术方法：研究人员收集了773株幽门螺杆菌临床分离株（主要来自美国各地，部分来自梅奥诊所患者），通过参考琼脂稀释法进行表型抗菌药物敏感性试验(AST)，检测对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、利福平和四环素的敏感性。随后，对成功培养的分离株进行全基因组测序(WGS)，使用Illumina NovaSeq平台进行短读长测序。对获得的序列数据进行生物信息学分析，包括使用SKESA进行基因组组装，使用BWA和SAMtools将序列比对到幽门螺杆菌26695参考菌株，使用BCFtools进行变异调用。进而开展了全基因组关联研究(GWAS)，使用Fisher精确检验分析单核苷酸多态性(SNPs)与表型耐药性的关联，并针对已知耐药相关基因（如23S rRNA, gyrA, pbp1, rdxA, rpoB等）进行靶向分析，评估错义突变与耐药性的关系。此外，还利用AlphaFold预测的蛋白质结构对常见突变进行了结构定位分析。

研究结果

分离株特征

在通过全基因组测序质量控制的530株分离株中，对阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、利福平和四环素的耐药率分别为9.4%、57.0%、45.3%、70.6%、27.5%和1.3%。这些分离株在美国境内没有显示出按地理位置的聚类，表现出显著的基因组多样性。根据基因组分类数据库(GTDB)进行分类，所有分离株在属水平上均被定义为幽门螺杆菌属(Helicobacter)，但在较低的物种分类水平上观察到了多样性，例如分别被分类为“Helicobacter pylori species”、H. pylori BU、H. pylori C等，凸显了该收集菌株的遗传多样性。

GWAS揭示不同测试抗生素的表型耐药性之间存在相关性差异

全基因组关联研究显示，除了克拉霉素和左氧氟沙星外，所有测试抗生素的表型耐药性与基因序列之间缺乏相关性。

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  左氧氟沙星: GWAS显示，只有HP_r01（23S rRNA）和gyrA中的单核苷酸多态性在左氧氟沙星耐药分离株中富集。针对gyrA的分析显示，残基87和91的错义突变在耐药株中富集。然而，有33株表型左氧氟沙星耐药的分离株在残基87和91处显示出“野生型”序列，并且这些分离株在gyrA其他位置或gyrB中均未发现富集的错义突变。
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  阿莫西林: 阿莫西林耐药分离株在11个基因中富集了单核苷酸多态性，包括fabD、cag17和ung。然而，在已知与阿莫西林耐药相关的青霉素结合蛋白(PBPs)中，特别是pbp1a，未发现耐药株与敏感株之间存在特定错义突变的关联。同样，与膜通透性降低相关的某些外膜蛋白(OMPs)也与耐药性无关联。
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  克拉霉素: 克拉霉素耐药分离株在23S rRNA基因(HP_r01)、vacA(HP_0887)以及cag16(HP_0537)和cag26(HP_0547)致病岛中富集了单核苷酸多态性。86%的克拉霉素耐药株携带23S rRNA基因中特征明确的A2147G、A2146G或A2146C突变。其余42株表型耐药但未携带上述突变的分离株，在基因组其他位置或23S rRNA基因其他区域均未发现富集的单核苷酸多态性。
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  甲硝唑: 甲硝唑耐药性与23S rRNA基因中的单核苷酸多态性相关。然而，这种关联很大程度上是由于甲硝唑耐药株与克拉霉素共耐药所致。当排除克拉霉素耐药株后，甲硝唑耐药性与23S rRNA基因突变无关联。此外，未发现甲硝唑耐药与frxA、fdxB或rdxA中的错义突变存在关联。
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  利福平: 未发现利福平表型耐药与任何特定的单核苷酸多态性相关，也未发现其与rpoB突变存在关联。
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  四环素: 由于耐药株数量过少，未进行详细的基因分析。

报告的耐药相关基因中错义突变的数量与表型耐药性无关

总体而言，对于每种抗生素，在全基因组范围内以及其各自的耐药相关基因中，耐药株和敏感株之间观察到的单核苷酸多态性/错义突变数量没有统计学上的显著差异。除了克拉霉素耐药株在23S rRNA基因中平均单核苷酸多态性数量高于敏感株外，阿莫西林、左氧氟沙星、甲硝唑和利福平的耐药株与敏感株在相关基因（如pbp1A, gyrA, rdxA, rpoB）中的平均错义突变数量均无显著差异。

报告的抗性相关基因中的结构畸变未被观察到

将耐药株和敏感株中最常见（按流行程度排名前10）的突变映射到预测的耐药相关基因蛋白质结构上，发现突变在耐药株和敏感株中广泛分布且重叠度高，并未发现耐药株的突变在蛋白质结构上形成特定的簇或热点区域。

讨论与结论

本研究通过对大规模幽门螺杆菌临床分离株进行全基因组测序和表型药敏试验的关联分析，揭示了其显著的基因组多样性，并明确指出除克拉霉素（与23S rRNA基因突变相关）和左氧氟沙星（与gyrA突变相关）外，对阿莫西林、甲硝唑和利福平的耐药性尚缺乏明确的基因型特征。研究发现，已知的耐药相关突变（如pbp1A中的S414R/N, rdxA中的C19Y和T49K）在本研究的耐药株和敏感株中均不一致地出现，且部分左氧氟沙星（30株）或克拉霉素（42株）耐药株并未携带gyrA或23S rRNA基因中已知的典型突变，这凸显了当前认知的空白。

研究结果强调了幽门螺杆菌基因组的复杂性和当前基于有限遗传标记预测其抗生素耐药性的局限性。鉴于幽门螺杆菌的遗传多样性，一个公开、稳健的幽门螺杆菌序列数据库对于开发用于药敏预测的分子工具至关重要。虽然目前存在评估幽门螺杆菌耐药性的分子检测方法，但基于本研究结果，对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性或敏感性进行分子预测是可行的，但对于阿莫西林、甲硝唑和利福平（和/或利福布汀）的耐药性或敏感性，基于现有知识是否能充分捕捉则尚不清楚。因此，迫切需要进一步阐明幽门螺杆菌中对阿莫西林、甲硝唑和利福平（和/或利福布汀）耐药的根本机制。

该研究也存在一些局限性，包括临床病史信息缺失、分离株在药敏试验和测序前经过冻存和传代可能引入遗传变异、部分分离株因生长失败或DNA质量差未能进行分析、短读长测序技术对重复区域和复杂遗传特征的分析限制、表型药敏试验本身的技术挑战（如甲硝唑活性对厌氧环境的依赖、利福平与利福布汀表型与基因型的不完全一致等），以及微生物全基因组关联分析中统计阈值选择、未能考虑非突变耐药机制（如代谢适应、外排泵上调、表观遗传效应等）和种群结构潜在偏倚等因素。

尽管存在这些局限性，本研究的结果清晰地表明，幽门螺杆菌临床分离株具有显著的基因组多样性，并且对阿莫西林、甲硝唑和利福平的耐药机制存在不完全的基因型表征。这项工作为未来更深入地探索幽门螺杆菌耐药机制，以及开发更全面、可靠的基因型药敏检测方法奠定了重要基础，对指导临床个体化治疗和遏制幽门螺杆菌耐药性传播具有重要意义。该研究发表于《iScience》期刊。