综述：软骨类器官从基础研究到临床转化

《iScience》：Cartilage organoids from basic research to clinical translation

本综述系统阐述了软骨类器官（COs）这一新兴三维模型在关节修复与组织再生研究中的前沿进展。文章重点探讨了COs在模拟软骨发育、稳态维持及骨关节炎（OA）等病理微环境方面的独特优势，并深入分析了其与微流控、生物打印等技术结合后，在疾病建模、药物筛选及个性化组织工程中的巨大转化潜力。同时，作者也客观评估了当前技术面临的挑战（如规模化、结构性保真度）与未来发展方向。

　　

引言

肌肉骨骼系统正面临人口老龄化、运动损伤和生活方式因素带来的日益严峻的挑战。骨关节炎（OA）等软骨疾病在全球范围内的患病率不断攀升。作为一种特殊的结缔组织，软骨通过其细胞外基质（ECM）和嵌入其中的软骨细胞，覆盖在关节表面，起到减少摩擦和吸收冲击的作用。软骨损伤会导致疼痛、肿胀和活动受限，严重影响生活质量。然而，当前的动物模型和二维（2D）细胞培养在模拟生理空间结构、ECM相互作用和细胞通讯方面存在局限，难以复现真实组织的复杂性。这凸显了对先进三维（3D）培养系统的迫切需求。

近年来，发育生物学和干细胞研究的进展揭示了在分子水平上控制干细胞和祖细胞行为的方法。软骨类器官（COs）作为源自干细胞的自组织三维结构，能够高度模拟天然软骨的特征，从而应运而生。现代COs已经能够模拟天然组织的结构和功能，在体外模拟生长、修复和疾病过程。

软骨发育、稳态与再生

关节软骨（AC）主要由软骨细胞和富含胶原纤维及蛋白聚糖的ECM构成，具有分层结构，包括表层、过渡层（中层）、深层（放射层）和钙化层。潮线（tidemark） demarcates 非钙化层与钙化层的边界。软骨细胞的大小从关节表面向软骨下骨逐渐增大，最终形成钙化、血管化的肥大细胞。AC通过血小板反应蛋白-1（TSP1）、软骨调节素-l、XVIII型胶原等多种抗血管生成因子维持其无血管和无神经的特性。营养和氧气交换仅通过扩散进行。AC在正常条件下再生能力有限，严重损伤常导致形成机械性能较差的纤维软骨修复组织。

在胚胎发生过程中，软骨前体细胞起源于骨骼形成区域的间充质凝聚。对牛和小鼠关节表面的研究发现，存在表达间充质干细胞（MSC）标志物的克隆形成细胞。这些对转化生长因子β（TGF-β）响应的祖细胞在软骨形成分化过程中上调蛋白聚糖4（PRG4）、聚集蛋白聚糖（ACAN）和II型胶原（COL II）的表达。关节发育始于胚胎第6周，由SRY-box转录因子9（SOX9）介导的软骨细胞分化驱动，该过程还受到印度豪猪蛋白（Indian Hedgehog）、骨形态发生蛋白（BMPs）和成纤维细胞生长因子（FGFs）的调控。谱系追踪揭示了GDF5⁺细胞群在E12.5小鼠中具有软骨形成潜力，并以双皮质素（doublecortin）表达为标记。

胚胎COs已成为解析发育和病理机制的有力模型。为了忠实地重述体内软骨发育，近期研究采用了以控制细胞本体论和谱系定型、重建生化与物理微环境、动态模拟发育和转化过程为核心的多元化策略。

软骨类器官的衍生

COs的发育依赖于软骨细胞的自我组织，这一过程可分为自我模式化和形态发生重排两个阶段。成功衍生COs的关键在于重现自我组织过程，这需要全面考虑培养环境的物理特性、信号需求以及起始细胞类型和系统条件。

软骨类器官的细胞来源

用于培养COs的细胞主要来源于两大类：通过消化从原代组织中分离提取的细胞，或从分离培养的干细胞分化而来的细胞。

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  分离培养的干细胞：包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）。iPSCs通过引入特定转录因子（如Yamanaka因子）将体细胞重编程为多能干细胞，在骨软骨组织工程中应用广泛。间充质干细胞（MSCs）主要来源于骨髓、脂肪组织等，具有向成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞分化的潜能。研究表明，脂肪来源的干细胞（ADSCs）因其易于获取、强大的自我更新能力等优势，在构建个性化骨组织工程模型方面显示出潜力。
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  从相应组织消化提取：人类骨膜来源细胞（HPDCs）富含骨骼干细胞，表现出比MSCs更高的再生能力。此外，软骨细胞也可直接从自体软骨组织消化获得，用于生成COs。将关节软骨细胞与MSCs共培养可缓解软骨细胞在体外扩增过程中的去分化问题。

模拟ECM的生物材料与COs组装方法

COs的组装主要有两种策略：无支架方法和基于支架的系统。无支架方法通过悬浮培养等技术诱导细胞自我聚集成球体，其优势是能密切模拟胚胎发育中的间充质凝聚过程，促进纯自体、类天然ECM的分泌。基于支架的系统则使用生物材料基质模拟天然ECM环境，为COs的生长、成熟和结构一致性提供关键的机械支持和生化线索。

ECM在生物系统中扮演双重角色，既提供结构支架，也通过生长因子 sequestration 和细胞因子呈递等方式主动调节细胞过程。胶原是软骨ECM的主要成分，具有优异的生物相容性和生物活性。透明质酸（HA）是一种普遍存在于各种组织中的线性糖胺聚糖，支持细胞迁移并维持基质水合作用。壳聚糖具有固有的血液相容性和抗菌作用。这些细胞性ECM组分与水凝胶、明胶或琼脂糖等结合，可构建成细胞支架复合物，增强细胞增殖、粘附和软骨形成分化。

此外，新兴的仿生系统显示出增强的调控能力。功能化纳米颗粒可作为生长因子的有效递送载体，并通过表面修饰主动调节细胞行为。刺激响应性水凝胶可以模拟天然ECM的动态特性，实现对类器官发育微环境的实时精确调控。特别是，适应性超分子水凝胶不仅能支持COs的快速增大，还能主动重编程细胞“糖酵解-乳酸化”代谢轨迹，增强软骨形成成熟。采用明确、生物相容的合成聚合物是克服传统基质（如Matrigel）批次间差异和成分不确定性的关键策略。脱细胞基质（DM）因其优异的生物相容性和无免疫排斥而被广泛使用。

可扩展性、成本与通量分析

目前，类器官、器官芯片和3D生物打印技术的广泛应用仍受限于可扩展性、成本和高通量能力三大核心挑战。3D生物打印和微流控技术能够以可重复的方式精确沉积细胞和水凝胶，显著提高了类器官生产的标准化和规模化潜力。在成本控制方面，这些技术通过提供更具生理相关性的疾病模型和药物筛选平台，能够更早、更准确地预测药物疗效和毒性，从而降低药物开发后期失败的相关成本。在与高通量能力相关的背景下，微流控技术与生物打印的集成是关键驱动力。微流控平台可以高通量地生成均匀的水凝胶微球或微纤维，这些模块化单元为快速、大规模组装3D组织奠定了基础。

软骨类器官的应用

疾病建模

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  遗传性软骨发育不良：利用患者特异性iPSCs分化的COs已成功模拟了由FGFR3基因功能获得性突变导致的生长板软骨细胞肥大和异常基质矿化。SOX9缺陷的CO模型揭示了该缺陷促进软骨细胞向成骨细胞转分化，并伴随TGF-β/BMP信号通路失衡。COMP基因突变引起的假性软骨发育不全模型证实了突变COMP蛋白在内质网中的异常滞留以及氧化应激标志物的上调，并用于筛选抗氧化剂的治疗效果。SLC26A2突变导致的硫酸盐转运缺陷模型为代谢性软骨病的机制研究和药物筛选提供了可靠平台。
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  继发性软骨病变：OA的核心病理特征包括软骨细胞肥大、ECM降解（伴随MMP13、ADAMTS5等分解代谢酶的上调）以及炎症细胞因子（如白介素-1β [IL-1β]）驱动的分解代谢过程。基于MSCs构建的工程化OA COs能准确模拟IL-1β诱导的软骨退变特征。研究还发现，IL-1会破坏软骨细胞的昼夜节律，而IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）或IL-1受体1基因敲除（IL-1R1-KO）可保护昼夜节律钟并防止软骨基质降解。TRPV4通道介导的异常机械信号转导在OA进展中起关键作用。异常机械负荷（如半月板损伤）会引发软骨细胞瞬时分化和ECM降解。基于丝素蛋白（SF）水凝胶构建的COs结合循环拉伸等机械刺激，能有效模拟损伤微环境。Wnt/β-catenin信号通路的过度激活会加速软骨细胞肥大和OA进展。利用CRISPR编辑的COs研究发现，Wnt信号通路通过上调Runx2基因表达加速软骨基质矿化。

近年来开发的包含成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞的滑膜类器官，已成为研究滑膜炎和筛选抗炎化合物的有价值工具。将滑膜模型与骨软骨类器官整合，对于揭示关节疾病的系统病理生理学和开发有效的再生及抗炎疗法至关重要。

软骨类器官的治疗应用

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  药物发现与毒性评估：COs通过构建高度逼真的病理模型，为OA等退行性疾病的药物筛选和毒性评估提供了新途径。例如，OA类器官模型证实IL-1Ra可通过抑制转录因子C/EBPβ信号通路有效逆转软骨降解过程。单细胞测序技术进一步揭示了Col11a1-HIF1α介导的糖酵解失调在软骨细胞衰老中的作用。与水凝胶整合的类器官平台可作为高通量药物筛选和毒性测试的标准化系统。集成骨/软骨多组织微环境的芯片类器官系统能够动态监测和精确评估药物对组织相互作用的影响。
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  个性化医疗：COs在构建个性化疾病模型和实施精准干预方面展现出巨大潜力。例如，借助单细胞测序技术，研究人员发现Col11a1-HIF1α通路介导的糖酵解失衡是导致发育性髋关节发育不良（DDH）小鼠模型软骨退变的关键机制，通过关节内注射Col11a1过表达的滑膜MSC类器官可有效恢复软骨细胞的代谢稳态。同样，从患者特异性iPSCs分化的COs可高度模拟软骨发育不全等遗传性骨骼疾病的病理特征，并通过基因编辑技术验证潜在治疗靶点。iPSC来源的COs已成功应用于灵长类动物关节缺损的修复。
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  再生医学：COs以其独特的三维仿生特性和强大的功能可塑性，在组织修复和功能重建领域显示出巨大的临床应用潜力。采用iPSC技术分化的COs已成功实现灵长类动物膝关节软骨缺损的长期修复。通过3D生物打印技术构建的关节仿生类器官，结合负载BMP的靶向水凝胶递送系统，可精准修复临界尺寸骨缺损。在颅面修复领域，弹性COs可通过自分泌ECM信号调控细胞命运，结合神经嵴干细胞（NCSCs）来源的类器官模型揭示的旁分泌网络，为颌面部复杂缺损的再生治疗提供了新策略。

解码机械微环境与发育信号

COs为探究软骨发育和疾病的基本机制建立了一个创新平台，尤其在阐明发育信号通路和机械微环境的关键作用方面具有独特优势。

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  重述与探索机械微环境：机械微环境（包括基质刚度、流体剪切应力和压缩负荷等因素）是软骨生物学的基石，它决定着软骨细胞的命运、代谢和病理。与机械适应性水凝胶结合的COs形成了稳定的复合系统，显著提高了细胞聚集体的机械稳定性，使得类器官在承受外部动态刺激（如冲击波、循环负载）时能保留其三维结构，有效克服了传统2D培养系统因不稳定的基质界面常引入显著伪影的实验局限。水凝胶技术与微流控系统的结合不仅能高效构建类器官，还能长期维持其生物学功能。藻酸盐、丝素蛋白等生物材料的引入优化了类器官的力学性能和生物相容性。
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  研究发育与再生信号通路：除了机械线索，COs还深刻增进了我们对发育生物学的理解。由iPSCs分化的软骨-成骨类器官系统清晰揭示了控制软骨成熟、肥大及向成骨细胞转化的关键基因表达谱，成功模拟了软骨内成骨的复杂过程。NCSCs来源的颅面COs借助单细胞测序技术，深入阐明了间充质细胞与新生软骨细胞之间的旁分泌信号网络及其对细胞命运决定的调控机制。基于LGR5⁺关节祖细胞构建的“微型关节”类器官已成为研究胚胎关节发育和OA病理机制的高保真模型。

从类器官到功能性骨软骨构建体

尽管COs在模拟软骨生物学和病理学方面显示出显著潜力，但现有模型主要集中在再生非钙化软骨区域。然而，成功临床修复全层骨软骨缺损的关键在于重建完整的界面结构（如钙化软骨区和软骨下骨）以及恢复生物力学功能和润滑机制。这些挑战无法单靠类器官解决，需要整合先进的生物材料工程策略。

具有微/纳米级梯度的双相/三相水凝胶已成为骨软骨再生的有前景的方法。利用成分梯度水凝胶可以重建对机械整合至关重要的钙化区，促进X型胶原（COL X）表达和矿化。刚度梯度进一步指导MSC迁移和钙化软骨形成，而像GDF-5这样的生长因子同时增强软骨形成和碱性磷酸酶活性。PRG4是维持关节低摩擦和耐磨性的关键蛋白。通过化学基团或聚合物刷进行表面修饰可以优化润滑素层稳定性并显著降低摩擦系数。与 abrupt 双相设计相比，通过引入钙化区和连续梯度，工程构建体与宿主组织的整合强度得到显著提高，促进了更平滑的负荷传递。

因此，将COs与战略性设计的梯度水凝胶相结合，是开发功能性骨软骨组织的一个重要方向。

前景与挑战

作为再生医学和疾病模型领域的显著突破，COs为全面分析软骨相关疾病的发病机制、制定靶向药物和实施再生疗法提供了一个高度逼真的仿生研究平台。然而，COs在临床转化中面临诸多挑战。主要限制在于可扩展性和结构保真度问题。当前的自组装方案通常产生毫米级或更小的类器官，缺乏天然AC的稳健机械性能和复杂的分区结构。在功能上，现有COs面临复制天然机械应力微环境和确保其无血管、缺氧核心内足够营养扩散两大挑战。从制造和安全角度看，实现批次间一致性是一个关键障碍。

为了克服这些障碍，几种有前景的策略正在涌现。将生物制造技术（如3D生物打印）与类器官技术整合，对于创建更大、解剖形状的构建体至关重要。展望未来，四维生物打印技术结合纳米结构控制，有望实现动态组织构建。功能化纳米颗粒可作为载体高精度递送生长因子，而纳米传感器可实时监测微环境参数以优化培养条件。开发提供动态机械刺激的先进生物反应器对于促进功能成熟仍然至关重要。此外，正在探索纳米复合支架（如掺入纳米羟基磷灰石以模拟天然基质无机成分）来增强移植物的机械性能和生物活性。

最后，建立标准化、安全且可重复的制造方案对于临床转化至关重要。这包括实施严格的质量控制措施，例如利用单细胞RNA测序监测细胞命运。将人工智能与纳米级高通量筛选平台整合，可以显著加速药物-纳米载体复合物的筛选和优化，从而增强类器官模型的实用性和预测能力。通过生物工程、纳米技术和人工智能的深度融合，并建立标准化的研究框架，COs有望超越当前局限，成为软骨再生医学的核心工具，加速从实验室研究向临床应用的转化飞跃。